多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑干預(yù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜炎Th1/Th2的影響

姚 祺,林東梅,林臻影,楊燕燕,莊躍宏

(1.福州市第二醫(yī)院,福建 福州 350007;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,福建 福州 350007;3.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350007)

子宮內(nèi)膜炎作為一種慢性炎癥,長期反復(fù)感染可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞的免疫平衡失調(diào),從而影響胚胎著床[1-2]。臨床研究表明,子宮內(nèi)膜炎患者存在Th1/Th2免疫偏向,即免疫應(yīng)答偏向于炎癥反應(yīng),而抑制胚胎植入所需的免疫耐受性反應(yīng)[3-5]。目前,臨床上治療子宮內(nèi)膜炎的主要方法是經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療。多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑聯(lián)合用藥已成為一線治療方案,環(huán)丙沙星也被廣泛采用[6-7]。許多臨床研究顯示,口服抗生素可以改善妊娠結(jié)局,但其具體機(jī)制仍不完全清楚[8]。Th細(xì)胞能夠分泌不同炎癥因子,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,子宮內(nèi)膜炎進(jìn)展中,炎癥導(dǎo)致大量細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等產(chǎn)生[9-10]。而在藥物長期治療中,由于耐藥性等因素導(dǎo)致患者病情反復(fù)發(fā)作,為促進(jìn)子宮內(nèi)膜炎疾病治療的效果,因此,本研究于2022年6月至2022年12月選取50只無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠成功孕育的SD雌性大鼠,飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,探討應(yīng)用多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑用藥觀察聯(lián)合用藥對(duì)慢性子宮內(nèi)膜炎(Chronicendometritis,CE)大鼠的Th1/Th2作用機(jī)制及效果,為慢性子宮內(nèi)膜炎治療提供建議。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

研究時(shí)間:2022年6月至2022年12月。選取50只SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠成功孕育的SD雌性大鼠,飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為包括空白組、大鼠子宮內(nèi)膜炎(CE)模型組、多西環(huán)素干預(yù)組、甲硝唑干預(yù)組及聯(lián)合用藥組,每組含10只大鼠,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在相同時(shí)間段出生,體重控制在(220±20)g,以符合實(shí)驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)室溫度被保持在18℃～26℃,相對(duì)濕度維持在45%～70%,光照強(qiáng)度在200～350照度,每天有12h的光照和12h的暗周期,且維持通風(fēng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由飲水?dāng)z食,喂養(yǎng)飼料相同,飼鼠所用飼料和墊料均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,空白組大鼠不接受任何干預(yù)處理,其余4組大鼠經(jīng)適量麻醉藥劑麻醉松弛,將麻醉后大鼠倒提,向子宮內(nèi)推注脂多糖(LSP),2.5～5 mL·kg-1的LSP,灌注12～24h后,建立大鼠CE模型,后連續(xù)灌胃給藥14d,同時(shí)模型組灌服生理鹽水90 mg·(kg·d)-1,多西環(huán)素干預(yù)組加以30 mg·(kg·d)-1灌胃多西環(huán)素片,甲硝唑干預(yù)組加以20 mg·(kg·d)-1灌胃甲硝唑,聯(lián)合用藥組灌胃多西環(huán)素30 mg·(kg·d)-1+甲硝唑20 mg·(kg·d)-1。本研究內(nèi)容經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)審閱同意開展本次研究。

1.2 取材、切片方法

不同干預(yù)組末次給藥2h后,取出大鼠稱取體重,后處死大鼠,麻醉后取腹主動(dòng)脈血并分離血清,置于-80℃冰箱備用;解剖分離并稱取子宮部位及附件等臟器重量,置于-80℃冰箱備用;部分組織固定,制作蘇木精-伊紅法(HE)染色切片。

1.3 RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光 PCR法

提取大鼠子宮組織RNA,于-80℃冰箱取出子宮組織,在電子天平上稱取約200mg,加入 800μL RNAiso Plus Total RNA 提取試劑,提取組織中總 RNA,One drop 儀器測(cè)定總 RNA 濃度,取 2.50 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)為 cDNA。同時(shí)按10μL實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為95 ℃,變性5min;95 ℃,10 s,60 ℃,30 s,72 ℃,30 s,共40個(gè)循環(huán);溶解曲線條件為95 ℃,15 s,65 ℃,15 s,95 ℃,continues。同時(shí)根據(jù)溶解曲線判斷PCR產(chǎn)物純度,分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1。

表1 不同炎癥因子qRT-PCR引物序列

1.4 觀察指標(biāo)

(1) 觀察不同分組大鼠子宮組織形態(tài)、子宮指數(shù)及病理改變。(2)取腹主動(dòng)脈血通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細(xì)胞介素2/4/6水平,同時(shí)通過全自動(dòng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1細(xì)胞亞群分泌TNF-α和IL-2,Th2細(xì)胞亞群分泌IL-4和IL-6,并計(jì)算Th1/Th2。(3) 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)子宮組織TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜炎模型組子宮組織病理學(xué)變化情況

不同組大鼠子宮組織病理學(xué)變化如圖1所示,模型組較空白組大鼠子宮宮腔出現(xiàn)粘連不全現(xiàn)象,子宮內(nèi)膜水腫、血管充血,有炎癥浸潤表現(xiàn),多西環(huán)素、甲硝唑單一干預(yù)下宮腔粘連、水腫、充血有所改善,內(nèi)膜損傷較輕,聯(lián)合組干預(yù)下宮腔無粘連,水腫、充血改善顯著,無明顯內(nèi)膜損傷情況。

2.2 不同子宮內(nèi)膜炎模型組Th1/Th2比較

不同大鼠子宮內(nèi)膜炎模型組Th1、Th2、Th1/Th2水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05,多西環(huán)素組、甲硝唑組及聯(lián)合用藥組Th1/Th2水平較模型組下降(P<0.05),且聯(lián)合用藥組較多西環(huán)素、甲硝唑單一用藥改善更顯著(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 不同大鼠子宮內(nèi)膜炎干預(yù)模型的炎癥因子比較

2.3 不同子宮內(nèi)膜炎模型組TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表達(dá)情況

與空白組比較,子宮內(nèi)膜炎模型組TNF-α、IL-4、IL-6mRNA水平降低(P<0.05),IL-2mRNA水平升高(P<0.05);與模型組相比,聯(lián)合用藥組TNF-α、IL-4、IL-6mRNA水平顯著降低(P<0.05),IL-2mRNA水平顯著升高(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2。

3 討論

近年慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率逐漸上升,給育齡婦女的身體健康和生育健康帶來了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)因素,其中免疫失衡是一個(gè)重要的方面[11]。在子宮內(nèi)膜炎的炎癥環(huán)境中,Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的免疫應(yīng)答出現(xiàn)偏向失衡,調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的免疫平衡,也成為治療子宮內(nèi)膜炎的重要策略之一[12-14]。為了深入研究子宮內(nèi)膜炎治療,本研究選擇了LPS誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜炎模型,探索多西環(huán)素與甲硝唑聯(lián)合用藥干預(yù)下大鼠子宮組織炎癥因子表達(dá)及治療效果。

本研究中,炎癥因子的水平也在不同組間呈現(xiàn)差異。既往的研究表明,該聯(lián)合干預(yù)方案能夠顯著改善子宮內(nèi)膜炎模型大鼠的癥狀和炎癥反應(yīng)[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)聯(lián)合用藥處理后,大鼠子宮內(nèi)膜的水腫、血管充血和炎癥浸潤現(xiàn)象均呈明顯減輕。同時(shí)本研究結(jié)果在姚琪[6]等人研究中也有證明,多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑用藥下明顯緩解子宮內(nèi)膜損傷、壞死、細(xì)胞浸潤等,改善子宮內(nèi)膜組織受損。研究表明TNF-α、IL-2/4/6等作為重要的炎癥細(xì)胞因子,能夠觸發(fā)炎癥細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而激活或擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[16-18]。Th細(xì)胞作為調(diào)控免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞,正常條件下Th1/Th2處于平衡狀態(tài),研究模型組大鼠Th1/Th2明顯失衡,CD4+T細(xì)胞過度活化,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)性和加重,進(jìn)而可能加速大鼠CE的進(jìn)展,多西環(huán)素、甲硝唑及聯(lián)合用藥組Th1/Th2失衡得到一定控制,同時(shí)聯(lián)合組Th1/Th2失衡改善更明顯,也提示聯(lián)合用藥有抑制CD4+T細(xì)胞增殖能力,引導(dǎo)Th2分化。而在不同造模組大鼠子宮組織中促炎細(xì)胞因子mRNA的檢測(cè)中,聯(lián)合組用藥對(duì)TNF-α、IL-2/4/6表達(dá)水平有顯著影響,減輕了子宮組織炎性反應(yīng)。同時(shí)提示多西環(huán)素及甲硝唑聯(lián)用可能通過調(diào)節(jié)免疫失衡和抑制炎癥反應(yīng),影響免疫應(yīng)答,發(fā)揮對(duì)子宮內(nèi)膜炎的保護(hù)作用,可能是治療子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)制之一。然而,本研究存在一定的局限性,研究尚需要臨床治療驗(yàn)證,同時(shí)對(duì)于多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑治療子宮內(nèi)膜炎的確切機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究,包括分子水平和細(xì)胞水平的機(jī)制分析等。

綜上所述,本研究表明多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑干預(yù)能夠改善子宮內(nèi)膜炎模型大鼠的癥狀和炎癥反應(yīng),可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子的水平來影響免疫應(yīng)答。同時(shí)研究需進(jìn)一步探究作用機(jī)制,以期為子宮內(nèi)膜炎的治療提供更加科學(xué)和有效的策略和方法。