高效液相色譜法測定維生素和礦物質復方制劑中維生素K2含量

楊善巖，黃鳳琴，劉麗云，馮鋒將

（杭州民生健康藥業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 311100）

天然維生素K 是一類脂溶性維生素，有維生素K1和維生素K2兩類［1］。其中，維生素K2又稱甲萘醌，是唯一具有生物活性的維生素K，維生素K1須在肝臟內轉化為維生素K2才能被人體吸收。維生素K2為系列化合物［1］，其中以七烯甲萘醌（MK-7）的生物活性和生物利用度最優(yōu)［2-4］。維生素K2是人體必需維生素，參與骨骼代謝和骨細胞生長［5］，日本于1995 年首次將其作為骨質疏松藥物應用于臨床［6］。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2具有廣泛的生物活性和藥用價值，如促進凝血［7］、防止并逆轉心血管鈣化［8］、降低2 型糖尿病風險［9］、預防老年癡呆［2］、預防肝硬化［10］、抗腫瘤［11-12］等。隨著維生素K2藥用價值的逐漸凸顯，其已成為藥品和保健品添加劑的熱點［13-16］。維生素K2遇光和堿不穩(wěn)定，但耐酸、耐熱，多通過微囊包埋增加穩(wěn)定性。包埋后有效提高了維生素K2的穩(wěn)定性，但也增加了檢測難度。因為囊殼多為高分子材料，檢測前需用溶劑將囊殼溶解，對維生素K2進行提取，整個過程要避免光、堿對維生素K2的降解，還要保證提取完全。單一原料中維生素K2的檢測方法相對簡單，采用異丙醇等溶劑直接萃取［17-21］，但不適用于復方制劑，特別是多種維生素和礦物質復方制劑。因為復方制劑基質復雜、不溶性成分較多，直接萃取法存在難以定容、提取不完全、雜質干擾嚴重等問題，嚴重影響定量的準確性。隨著老齡化的加劇和人們健康意識的提高，維生素K2相關的藥品和保健品研發(fā)成為熱點。但缺少適用于多種維生素和礦物質復方制劑中維生素K2的國標檢測方法。故本研究中建立了適用于測定多種維生素和礦物質復方制劑中維生素K2含量的高效液相色譜法，為此類藥品和保健品的開發(fā)及質量控制提供保障。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT125D 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器<北京> 有限公司，精度為十萬分之一）；1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；IKA Multi Drive MI 250型粉碎機（德國IKA公司）；KQ-300DE型超聲波振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為1 000 W，頻率為45 kHz）；ST16R型離心機（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

21 金維他?多種維生素礦物質片（小試樣品，杭州民生健康藥業(yè)股份有限公司，批號為H20H007）；MK-7標準品（美國Usp Reference Standard 公司，批號為R080L0，純度為97.80%）；甲醇、異丙醇（色譜純，德國Merck 公司）；鹽酸（分析純，國藥集團藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo 30105-154630型ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：50 ℃；進樣量：50 μL。

2.2 溶液制備

精密量取濃鹽酸（36.0%～38.0%）125 mL，置500 mL容量瓶中，用異丙醇定容，即得異丙醇- 3 mol/L 鹽酸溶液。

避光操作，取KM - 7 標準品10 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加適量異丙醇-3 mol/L鹽酸溶液，超聲15 min使溶解，定容，即得質量濃度為100 μg/mL的MK-7 標準品貯備液；精密移取MK-7 標準品貯備液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加異丙醇- 3 mol/ L鹽酸溶液稀釋并定容，即得質量濃度為10 μg/ mL 的MK-7標準品溶液。

避光操作，取樣品粉末（過80目篩）2.0 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，精密量取異丙醇-3 mol/L鹽酸溶液50 mL，搖勻，超聲［功率為（1 000 ± 5）W，頻率為45 kHz± 5 kz］振蕩20 min（每10 min 搖勻1 次），超聲結束后，常溫離心（轉速為8 000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察［22-24］

專屬性試驗：精密量取空白溶液（異丙醇-3 mol/L鹽酸溶液）及2.2 項下MK-7 標準品溶液、供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液和MK-7標準品溶液色譜中均在7.5～8.5 min 處有吸收峰，且空白溶液無干擾。詳見圖1。

1.MK - 7A.空白溶液 B.MK - 7標準品溶液 C.供試品溶液圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖1.MK - 7A.Blank solution B.MK - 7 standard solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關系考察：精密量取2.2項下MK-7標準品溶液（質量濃度為10 μg/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，用異丙醇-3 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容至10 mL，即得質量濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/mL 的系列標準品溶液（臨用現(xiàn)配），按2.1項下色譜條件進樣測定，以MK-7 標準品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=65.47X+0.04（R2=0.999 9，n=6）。結果表明，MK-7標準品的質量濃度在0～1.0 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：取MK - 7 標準品適量，按2.2項下方法制備質量濃度為0.001～0.020 μg/mL 的標準品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以信噪比（S/N）為3 時的標準品濃度確定檢測限，以S/N為10時的標準品濃度確定定量限。結果檢測限為0.12 μg/g，定量限為0.36 μg/g。

精密度試驗：取樣品6 份，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，按公式C=C0V/m計算含量（式中，C為樣品中MK-7 的含量，C0為由標準曲線計算得到的樣品中MK - 7 的含量，V為樣品定容體積，m為樣品質量）。結果含量的RSD為2.85%（n=6），均值與理論值的偏差為1.67%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下MK-7 標準品溶液適量，分別于室溫放置0，1，2，4，8，12 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算MK-7標準品的含量。結果的RSD為0.99%（n=6），表明MK-7標準品溶液在室溫放置12 h內穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品1.0 g，精密稱定，共9 份，分別置100 mL 棕色容量瓶中，分別按低（80.00%）、中（100.00%）、高（120.00%）濃度加入質量濃度為10 μg/mL的MK - 7 標準品溶液1.0，1.2，1.5 mL，各3 份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Result of the recovery test（n = 9）

3 討論

3.1 前處理條件優(yōu)化

維生素K2人體需要量微小，在產品中的含量多以微克（μg）計，產品中往往含有一些不溶或難溶的原輔料，特別是一些復雜的維生素和礦物質復方制劑（如21金維他?）往往含有十幾種甚至二十幾種原輔料，樣品前處理困難。因此，根據(jù)產品特點，通過提取液定量的形式，結合超聲提取、離心分離法最大限度地提高維生素K2的提取率。同時，為避免維生素K2見光分解而影響檢測的準確度，試驗過程應全程避光。

3.2 色譜條件選擇

影響檢測結果準確定量的最主要因素為前處理過程中維生素K2的提取率，但文獻［16］中記載的方法主要適用于維生素K2含量較高的原料級別的測定，而維生素和礦物質復方制劑中維生素K2含量較微量，故本研究中以50 μL為進樣量。

3.3 檢測波長選擇

取MK - 7 標準品適量，采用紫外- 可見分光光度計于200～400 nm 波長范圍內掃描，結果MK - 7 標準品溶液于254 nm波長處有較大紫外吸收，故選擇254 nm為檢測波長。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結果準確、穩(wěn)定性好，符合相關指南［22-24］要求，可滿足藥品、保健品領域研發(fā)或生產過程中多種維生素和礦物質復方制劑中維生素K2的定量檢測。