高效液相色譜法測定蒲公英中菊苣酸含量的不確定度評定

趙貴琴，冷崇姣，趙 悅，徐 洋

（重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶 402160）

蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicumHand-Mazz.、堿地蒲公英Taraxacum borealisinenseKitam.或同屬數(shù)種植物的干燥全草，2020 年版《中國藥典（一部）》含量測定項下將指標(biāo)性成分由咖啡酸更改為菊苣酸［1］。為此，本研究中基于《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1 - 2012）［2］、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS - GL006：2019）［3］及《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）［4］，并參考文獻［5-10］，采用高效液相色譜（HPLC）法測定蒲公英的含量，進行不確定度分析，找出試驗過程中的影響因素，提高測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為檢驗檢測報告的合理評價提供可靠依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Scientfic 儀器有限公司）；XP205 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司，精度為十萬分之一）；Milli-QDirect8 型超純水機（美國Millipore 公司）；IDH20 型超聲波提取器（愛安姆科技北京有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

蒲公英飲片（某藥業(yè)有限公司，批號為220701）；菊苣酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111752-202105，含量為98.3%）；甲醇、甲酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge Shield RP18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1 mL/ min；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

取菊苣酸對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL 含菊苣酸0.2 mg 的溶液，即得對照品溶液。取樣品粉末（過4 號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 測定方法

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算含量。

2.4 方法學(xué)考察

以菊苣酸對照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y=4 195.2X-159.94，r= 0.999 6，表明菊苣酸質(zhì)量濃度在0.224～2.243 mg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。按2.1項下色譜條件對同一對照品溶液重復(fù)進樣測定6 次，結(jié)果的RSD為0.71%（n= 6），表明儀器精密度良好。依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別于0，2，4，6，12，24 h 時進樣測定，結(jié)果的RSD為1.93%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結(jié)果的RSD為0.48%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。加樣回收試驗的回收率為101.08%，RSD為1.12%（n= 6），表明方法準(zhǔn)確度好。

2.5 含量測定的不確定度評估

2.5.1 數(shù)學(xué)模型建立

根據(jù)高效液相色譜外標(biāo)法以峰面積為指標(biāo)計算含量的基本原理，按公式（1）計量蒲公英中菊苣酸含量。

式中，X為蒲公英中菊苣酸的含量（%）；A供為供試品峰面積；W對為對照品稱樣量；p為對照品純度；V供為供試品溶液稀釋體積；A對為對照品峰面積；W供為供試品稱樣量；V對為對照品溶液稀釋體積。

2.5.2 不確定度來源識別

由含量測定過程和數(shù)學(xué)模型可知，供試品溶液中菊苣酸的含量測定不確定度來源包括對照品純度，對照品、供試品稱樣量，對照品溶液、供試品溶液制備過程中稀釋體積，對照品、供試品峰面積，液相色譜儀器性能穩(wěn)定性。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分析與計算［11-18］

1）對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［u（rp）］

菊苣酸對照品說明書中未提供相關(guān)不確定度的參考數(shù)值，假定其分散區(qū)間的半寬度α= 0.25%，按矩形分布，包含因子（k）為，則u（rp）= 0.25%/（×98.3%）=1.47×10-3。

2）對照品稱樣量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［u（rW對）］

所用電子天平（d=0.01 mg）示值的最大允許誤差為±0.05 mg，天平重復(fù)性的最大允許誤差為0.02 mg，服從矩形分布k=。稱取菊苣酸對照品2份，稱量值分別為11.35 mg和10.94 mg，故天平稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u1= 0.05/= 2.89 × 10-2，u2= 0.02/=1.15×10-2。

3）對照品溶液制備過程中稀釋體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［u（rV對）］

示值誤差：根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）規(guī)定，50 mL A級容量瓶容量允許誤差為±0.05 mL，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按三角分布k=，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u校準(zhǔn)（V對）=0.05/=2.04×10-3。

溫度：容量瓶校準(zhǔn)溫度為20 ℃，而本研究中溫度在（20±5）℃范圍內(nèi)，甲醇體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3℃，水體積膨脹系數(shù)為2.07×10-3℃，則80%甲醇體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃，溫度變化服從矩形分布k=，則u溫度（V對）=5×1.37×10-3×50/?=1.40×10-1。

由2種 分 量 合 成 得ur（V對）=［u校準(zhǔn)(V對)2+u校準(zhǔn)(V對)2］0.5/50=2.83×10-3。

4）對照品峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［u（rA對）］

取對照品溶液，平行2 份，按2.1 項下色譜條件分別進樣測定3 次，記錄峰面積X（A對1）為8 421.52，8 438.86，8 421.54，平均值為8 427.31，極差（R）為17.34，用極差法計算，取n= 3 時的極差系數(shù)（C）為1.69，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為S（A對1）=R/C= 10.26，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（rA對1）= 1.22 × 10-3。X（A對2）為7 886.14，7 878.45，7 884.91，平均值為7 883.17，R為7.69，S（A對2）=4.55，u（rA對2）=5.77×10-4，合成對照品色譜峰面積不確定度u（rA對）=1.35×10-3。

5）供試品稱樣量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［u（rW供）］

所用電子天平（d=0.01 mg）示值的最大允許誤差為±0.05 mg，天平重復(fù)性的最大允許誤差為0.02 mg，服從矩形分布k=。稱取供試品2 份，稱量值分別為470.3 mg 和503.7 mg，故天平稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u1= 0.05/= 2.89 × 10-2，u2= 0.02/=1.15×10-2。

ur（W供）=［(3.11× 10-2/470.3)2+（3.11 × 10-2/503.7）2］0.5=9.05×10-5

6）供試品溶液制備過程中稀釋體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［ur（V供）］

示值誤差：根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）規(guī)定，20 mL A 級單標(biāo)移液管允許誤差為±0.030 mL，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按三角分布k=，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u校準(zhǔn)（V供）=0.030/=1.22×10-2。

溫度：移液管校準(zhǔn)溫度為20 ℃，而本研究中溫度控制在（20 ± 5）℃范圍內(nèi)，甲醇體積膨脹系數(shù)為1.2 ×10-3℃，水體積膨脹系數(shù)為2.07 × 10-3℃，則80%甲醇體積膨脹系數(shù)為1.37 × 10-3℃，溫度變化服從矩形分布k=，則u溫度（V供）=5×1.37×10-3×20/=7.91×10-2。

由2 種 分 量 合 成 得 到ur（V供）=［u校準(zhǔn)(V供)2+u校準(zhǔn)(V供)2］0.5/50=8.00×10-2。

7）供試品峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［ur（A供）］

取供試品溶液，平行2 份，按2.1 項下色譜條件分別進樣測定2 次，記錄峰面積X（A供1）為997.57 和999.54，平均值為998.56，R為1.97，用極差法計算，取n= 2 時的C為1.13，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為S（A供1）=R/C=1.74，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（A供1）=1.74×10-3。X（A供2）為1 087.33 和1 090.15，平均值為1 088.74，R為2.82，S（A供2）=2.50，ur（A供2）=2.29×10-3，合成供試品色譜峰面積不確定度ur（A供）=2.88×10-3。

8）儀器性能穩(wěn)定性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［ur（E）］

根據(jù)儀器檢定證書提供的整機性能定量重復(fù)性為0.54%，按矩形分布k=，則u（rE）= 0.54%/=3.12×10-3。

2.5.4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總

將8個分量的數(shù)值、相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及其所占百分比進行歸納，詳見表2。

表2 各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分布Tab.2 Distribution of relative standard uncertainty of each component

2.5.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

ur（X）2=ur（A供）2+ur（W對）2+ur（A對）2+ur（W供）2+ur（p）2+ur（V對）2+ur（V供）2+ur（E）2=0.006 4

ur（X）=0.08

供試品中菊苣酸的含量為0.14%，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（X）=C×ur（X）=0.14%×0.08=0.01%。

2.5.6 擴展不確定度評定

假定蒲公英中菊苣酸含量的測定結(jié)果符合正態(tài)分布k=2，置信概率為95%時，擴展不確定度為u=k×u（X）=2×0.01%=0.02%。

2.5.7 檢驗結(jié)果

以測定值± 擴展不確定度表示，蒲公英中菊苣酸含量最終測定結(jié)果為（0.14±0.02）%，k=2。

3 討論

本研究中不確定度影響因素除對照品和供試品的稱量、制備及稀釋過程中的溫度、玻璃容器的校準(zhǔn)外，還將高效液相色譜儀的性能納入評定范圍。由表2 可知，檢驗過程中供試品溶液稀釋體積的影響占比最大。在藥品分析與檢測過程中，應(yīng)定期對玻璃儀器進行校準(zhǔn)，并嚴格控制實驗室環(huán)境條件，并進行規(guī)范化操作。對照品的稱樣量對含量測定過程有較大影響，在日常工作中要盡量減少因稱量帶來的誤差影響，更好地控制藥物分析的結(jié)果。儀器性能在一定程度上會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，定期對儀器進行期間核查和檢定校準(zhǔn)，加強儀器的維護保養(yǎng)，確保儀器始終處于良好的工作狀態(tài)，有助于提高檢驗的準(zhǔn)確性［19-20］。

綜上所述，為提高試驗數(shù)據(jù)的可靠性，降低試驗報告的風(fēng)險，在檢驗工作中的數(shù)據(jù)邊緣臨界值或低于標(biāo)準(zhǔn)限值時引入不確定度分析更具有說服力，通過不確定度評定提高日常檢驗工作質(zhì)量。本研究結(jié)果可為高效液相色譜法測定其他中藥飲片含量的不確定度評定提供參考。