基于活性成分和α-葡萄糖苷酶抑制作用的組織培養牡荊遺傳穩定性評價*

周 梅，孟 雪，薛建平，段永波，趙豐蘭△

（1.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230001； 2.淮北師范大學生命科學學院·安徽省特色資源植物利用工程實驗室，安徽 淮北 235000）

糖尿病為全球三大慢性病之一，近年來發病率呈增長趨勢［1］，嚴重影響患者的生活質量及健康。糖尿病分為1型和2型，其中2型糖尿病患者占比超過95%［2］，患者需長期依賴降糖藥。α-葡萄糖苷酶是糖尿病藥物篩選時的重要靶標［3］，是水解葡萄糖苷鍵釋放的葡萄糖關鍵酶。阿卡波糖作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的常用藥物，作用溫和而持久，但存在不良反應［4］，故從植物源中挖掘新型糖尿病治療藥物成為研究熱點［5］。牡荊Vitex negundovar.cannabifolia為馬鞭草科牡荊屬藥用植物，以葉入藥，具有抑菌、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、抗氧化等活性［6］。牡荊葉中典型的活性成分為牡荊素，具有較強的抗糖尿病活性［7］。牡荊主要為野生資源，未開展廣泛的人工標準化種植，牡荊素多從其他來源植物中提取而得［8］，故開展牡荊組織培養并進行全面評價對于牡荊的規模化和標準化種植意義重大。李旭群等［9］對牡荊組織培養進行了相關研究；本課題組孟雪［10］也以未萌發腋芽為外植體建立了牡荊高效再生體系，但基于活性成分的遺傳穩定性評價尚未開展。本研究中比較了不同溶劑對組織培養牡荊葉活性成分提取的影響，并分析了提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以評價組織培養牡荊的遺傳穩定性，為開發抗糖尿病藥物提供參考，同時為組織培養牡荊的規模化種植提供科學支撐。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex U3000 型液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；JA2003型電子天平（上海菁海儀器有限公司，精度為0.1 mg）；紫外- 可見分光光度計（上海聯通儀器有限公司）；CW-2000型超聲-微波協同萃取儀（上海新拓微波溶樣測試技術有限公司，功率為900 W，頻率為50 kHz）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試藥

對硝基苯基-α - D- 吡喃葡萄糖苷（pNPG，梯希愛< 上海> 化成工業發展有限公司，批號為wkq20071504，純度為98%）；α -葡萄糖苷酶（批號為G5003，純度為98%），蘆丁（批號為100080-201811，純度為92.6%），均購自索萊寶生物科技有限公司；牡荊素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為111687-201704，純度為98%）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯為分析純或色譜純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮提取與含量測定

以野生牡荊和本課題組前期獲得的組織培養苗移栽5 個月的牡荊植株葉片為試驗樣品（批號為2021011）。取野生和組織培養牡荊葉適量研磨成粉，取1 g，分別用乙酸乙酯、酸性乙醇（pH 1.33）、70%乙醇溶液、丙酮于超聲微波萃取儀萃取，真空干燥離心機抽濾，即得牡荊葉提取物。以蘆丁為對照制作標準曲線，測定總黃酮含量［11］。取蘆丁制成質量濃度分別為200，400，600，800，1 000 μg/mL的系列標準溶液，于510 nm波長處測定吸光度值（A510）。以A510（X）為橫坐標、蘆丁質量濃度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=164.21X- 12.82（R2= 0.991 6，n= 5）。取牡荊葉提取物，用甲醇溶解，測定A510，按標準曲線換算成黃酮含量［mg/g（以鮮重計）］。結果見圖1 A。

2.2 高效液相色譜（HPLC）法測定牡荊素含量

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：518905-902 Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）- 0.1%甲酸水溶液（A），梯 度 洗 脫（0～30 min 時60%B，30～35 min 時60%B →100%B，35～37 min 時100%B →10%B，37～42 min時10%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。每次進樣前用初始流動相平衡10 min。在此色譜條件下，牡荊素色譜峰與樣品中其他成分的色譜峰分離度均大于1.5，理論板數按牡荊素峰計不低于5 000。色譜圖見圖2。

1.牡荊素A.對照品溶液 B.供試品溶液圖2 高效液相色譜圖1.VitexinA.Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取牡荊素對照品2.50 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配成質量濃度為100 μg/mL的牡荊素貯備液，用甲醇梯度稀釋得質量濃度分別為20，40，60，80，100 μg/ mL 的系列對照品溶液。取牡荊葉提取物，用甲醇溶解，溶液經0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取2.2.2項下系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以牡荊素質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.215 3X+0.024 18（R2= 0.998 4，n= 5）。結果表明，牡荊素質量濃度在20～100 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下質量濃度為20，60，100 μg/mL 的對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定5次，記錄峰面積。結果的RSD分別為0.97%，1.14%，1.05%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為2021011）樣品6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算牡荊素含量。結果牡荊素含量的RSD為0.45%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為2021001）樣品適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，6，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.17%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為2021011）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別加入相當于供試品溶液中牡荊素含量50%，100%，150%的牡荊素對照品，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果平均回收率為99.72%，RSD為1.21%（n=9），表明方法準確性良好。

2.2.4 組織培養和野生牡荊葉的牡荊素含量測定

取2.1 項下不同溶劑牡荊葉提取物適量，用甲醇溶解，制成質量濃度為0.1 mg/ mL 的供試品溶液，經13 000g離心10 min后取上清液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算牡荊素含量。結果不同溶劑對牡荊活性成分提取效果的影響依次為酸性乙醇（pH 1.33）>70%乙醇溶液>丙酮>乙酸乙酯。詳見圖1 B。

2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗

參照林海生等［12］的試驗方法，在450 μL 0.1 mol/L PBS（pH=6.8）中加50 μLα-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL）和各溶劑牡荊葉提取物（1.82 mg/mL），37 ℃保溫10 min，加入50 μL 質量濃度為3 mg/ mL 的pNPG 溶液，混勻，37 ℃反應20 min，加入800 μL（0.1 mol/L）Na2CO3溶液終止反應，測定405 nm 波長處吸光度（A405）。按公式抑制率（%）=1-（A樣品-A樣品空白）/（A對照-A空白）計算抑制率。式中，A樣品為樣品組吸光度值（樣品+ 酶+pNPG）；A樣品空白為樣品空白組吸光度值（樣品+ PBS +pNPG）；A對照為對照組吸光度值（PBS + 酶+ pNPG）；A空白為空白組吸光度值（PBS+PBS+pNPG）。

當野生和組織培養牡荊葉提取物質量濃度為1.82 mg/mL 時，酸性乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著高于其他3種溶劑提取物，且抑制率與各溶劑所提取總黃酮含量變化趨勢一致，表明黃酮是牡荊抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物質。詳見圖3。

圖3 不同溶劑提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of extracts extracted with different solvents on inhibitory rate against α - glucosidase

將抑制效果最好的組織培養和野生牡荊葉酸性乙醇（pH 1.33）提取物稀釋成質量濃度分別為1.32，1.36，1.40，1.44 mg/ mL，按上述方法反應，并測定A450，繪制抑制率曲線，計算半數抑制濃度（IC50）。根據測試提取物濃度，反應后測定吸光度，計算抑制率。得抑制率對野生牡荊葉總黃酮質量濃度的擬合曲線為Y野=0.073 0X野+0.399 5（R2=0.982 4），以抑制率為50%計算得IC50為1.37 mg/mL；組織培養牡荊葉擬合曲線為Y組=0.099 1X組+0.361 1（R2=0.984 7），以抑制率為50%計算得IC50為1.41 mg/mL。結果表明，組織培養與野生牡荊葉對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用相當。

2.4 牡荊葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究

制備質量濃度為1.44 mg/mL的酸性乙醇（pH 1.33）提取物，與20，40，60，80，100 mg/Lα -葡萄糖苷酶反應，按2.3 項下方法測定吸光度，以不添加（0 mg/mL）提取物為對照組，計算反應速率。以α-葡萄糖苷酶質量濃度為橫坐標（X，mg/ mL）、抑制速率［Y，以每分鐘405 nm 波長處的光密度變化值（ΔOD405）］為縱坐標，確定牡荊葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線和抑制類型。結果見圖4。可見，野生和組織培養牡荊葉提取物抑制速率均通過原點，表明其對α-葡萄糖苷酶的抑制類型均為可逆性抑制。

A.野生 B.組織培養圖4 牡荊葉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制動力學曲線A.Wild Viticis Negundo Folium B.Tissue-cultured Viticis Negundo FoliumFig.4 Kinetic curves of extracts from Viticis Negundo Folium inhibiting α - glucosidase

3 討論

組織培養是植物脫毒復壯的重要途徑，也是實現藥用植物標準化種植的必要技術［13］。不同組織培養條件下再生苗可能出現一定變異，故組織培養苗需進行遺傳穩定性分析。關于組織培養苗的穩定性評價多集中在DNA 水平［14-15］，從代謝水平深入評價其穩定性對于組織培養苗的大規模種植十分重要［16-17］。本研究在前期建立的牡荊組織培養體系基礎上，基于活性成分和對α-葡萄糖苷酶的抑制作用對組織培養牡荊進行了遺傳穩定性評價。

溶劑是決定不同植物活性成分的提取率的重要因素之一。本研究中比較了4種溶劑對牡荊葉總黃酮成分的提取效果，結果顯示，酸性乙醇（pH 1.33）為牡荊葉總黃酮提取的最佳試劑，所提取的野生和組織培養牡荊中，總黃酮和牡荊素含量均遠超其他3種溶劑，與文獻［18］的研究結果一致。表明酸性乙醇（pH 1.33）作為溶劑能實現牡荊活性成分的高效提取與分離，可為后期研究牡荊活性成分的規模化提取方法提供參考。

作為牡荊主要的黃酮成分之一，牡荊素在預防和治療多種疾病方面都有重要作用［19-20］，其可作為α -葡萄糖苷酶抑制劑用于糖尿病治療［21］。體外酶活抑制試驗不涉及大鼠等模型動物的使用，僅在合適溫度條件下即可完成活性測定，為酶活力分析提供了一種簡易方法。因此，本研究中采用體外酶活抑制試驗考察提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率，比較組織培養與野生牡荊的差異，評價組織培養牡荊的遺傳穩定性。結果顯示，以酸性乙醇（pH 1.33）為溶劑的牡荊葉提取物對α -葡萄糖苷酶表現出良好的抑制效果，組織培養與野生牡荊葉的IC50分別為1.41 mg/ mL 和1.37 mg/ mL，表明組織培養與野生牡荊葉對α-葡萄糖苷酶的抑制作用相當。牡荊葉提取物對體外α -葡萄糖苷酶抑制作用的IC50低于藥用植物紅景天［21］，故進一步分析了牡荊葉提取物對α -葡萄糖苷酶的抑制特征。結果顯示，其抑制類型為可逆性抑制，表明牡荊葉提取物是通過非共價鍵與α-葡萄糖苷酶分子結合而抑制其活性的，臨床治療中可用簡單方法去除抑制劑而恢復α-葡萄糖苷酶活性［22］。可見，牡荊具有深入開發為α-葡萄糖苷酶抑制劑的潛力，為糖尿病的治療提供新方法。

綜上所述，組織培養牡荊遺傳穩定性較高，在組織培養過程中未發生實質性的遺傳變異；體外α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗可作為牡荊遺傳穩定性評價的簡易方法，為牡荊組織培養苗的標準化種植提供理論和技術基礎。