真空衰減法測定勞拉西泮注射液的包裝密封性*

高梓真，毛文星，周 琪，金 鑫，王佳瑜，許向陽△

（1.江蘇恩華藥業股份有限公司藥物研究院·江蘇省中樞神經藥物研究重點實驗室，江蘇 徐州 221000； 2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·國家藥品監督管理局麻醉精神藥品質量監測重點實驗室，重慶 401121）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VeriPac455 - M5 型真空衰減檢漏儀（美國PTI 公司）；FCO210型流量計（英國Furness公司）；HVA 110型高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；ESCO AC2 - 4S1 型生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Memmert INB500型恒溫培養箱（德國Memmert公司）；BX51-32型顯微鏡（日本Olympus 公司）；MFY - HS 型智能密封儀（濟南三泉中石實驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

中硼硅玻璃管制注射劑瓶（批號為220092001），抗生素瓶用鋁塑組合蓋（批號為S2009001），注射液用鹵化丁基橡膠塞（溴化，批號為S200811501），均購自山東力諾特種玻璃股份有限公司；銅綠假單胞菌［中國食品藥品檢定研究院，編號為CMCC（B）10104，代數為3］；胰酪大豆胨液體培養基（批號為20200903），綠膿菌素測定培養基（批號為20201012），均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；勞拉西泮注射液（江蘇恩華藥業股份有限公司，規格為每支1 mL∶2 mg，批號分別為SLZ220901，SLZ220902，SLZ220903）。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

陽性樣品：參照ASTM F2338 - 09，采用激光打孔法制備名義孔徑為3，5，10 μm的陽性樣品，并通過流量計校準孔徑大小，結果見表1和圖1。向空陽性瓶中分別加入1 mL 勞拉西泮注射液，軋蓋，密封，即得真空衰減法陽性樣品。在無菌環境下，向空陽性瓶中加入1 mL無菌胰酪大豆胨液體培養基，軋蓋，密封，即得微生物挑戰法陽性樣品。

A - C.陽性樣品（名義孔徑分別為3，5，10 μm） D - E.漏孔照片圖1 不同孔徑激光打孔陽性樣品A - C.Positive samples（with nominal pore sizes of 3，5，and 10 μm，respectively） D - E.Photos of laser perforation leakageFig.1 Positive samples with different pore sizes by laser drilling

表1 不同孔徑陽性樣品校驗結果（μm）Tab.1 Results of positive samples with different pore sizes（μm）

陰性對照樣品：選用流量計模擬孔徑進行樣品線性研究，流量計流量與漏孔孔徑對應關系見表2。以泄露量（X，cc/min）為橫坐標、差壓平均值（Y，Pa）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=474.72X+17.82，結果表明線性良好（R2=0.999 6，n=6）。取生產線上生產的完好產品，經流量計檢測，取泄漏量為0 cc/min 的樣品，即得真空衰減法陰性對照樣品。在無菌環境下，向藥品包裝中加入1 mL 無菌胰酪大豆胨液體培養基，軋蓋，密封，經流量計檢測，取泄漏量為0 cc/min 的樣品，即得微生物挑戰法陰性對照樣品。

表2 流量計流量與漏孔孔徑對照表（cc/min）Tab.2 Correspondence between the flow rate of the flow meter and the diameter of the leakage hole（cc / min）

2.2 真空衰減法參數選擇

對測試壓力（真空度）、平衡時間（保壓時間）、測試時間、泄壓時間進行優化，參數見表3。

表3 勞拉西泮注射液真空衰減法檢測參數Tab.3 Detection parameters of Lorazepam Injection by the vacuum decay method

2.3 方法學驗證

泄漏閾值（P/ F 值）確定：以絕壓值和差壓值為依據，以勞拉西泮注射液為陰性樣品進行測試，共測試3 d，每天測試30 支，總共不少于90 次。結果陰性對照樣品的平均絕壓值為433.8 mbar，平均差壓值為14.0 Pa，標準偏差（σ）分別為0.5 和0.6。按“平均值+ 6σ”進行計算，絕 壓P/ F 閾 值 為436.8 mbar，差 壓P/ F 閾值 為17.6 Pa。詳見表4。后續檢測樣品時，若絕壓檢測值大于絕壓P/F 閾值或差壓檢測值大于差壓P/F 閾值時，則判定為“泄漏”；反之，則判定為“不泄漏”（大漏樣品通過絕壓P/F閾值來判斷）。

表4 陰性樣品壓力檢測結果（n=30）Tab.4 Results of the pressure test of negative samples（n = 30）

準確度試驗：將5支陰性對照樣品和不同孔徑的陽性樣品各4 支隨機混合，分3 個時間段（T1，T2，T3）進行檢測，記錄泄露情況。陰性對照樣品的檢測結果為不泄漏（-）時為準確，陽性樣品為泄漏（+）時為準確。結果陰性對照樣品的檢測結果均為不泄漏，名義孔徑為3，5，10 μm 的陽性樣品的檢測結果均為泄漏，表明方法準確度為100.00%。詳見表5。

表5 準確度試驗結果Tab.5 Results of the accuracy verification test

重復性試驗：將5支陰性對照樣品和不同孔徑的陽性樣品各4 支隨機混合，分3 個時間段（T1，T2，T3）進行檢測，記錄差壓值和絕壓值。結果重復性試驗的RSD均小于10%，表明方法重復性良好，能滿足樣品的密封完整性檢測。詳見表6。

表6 重復性試驗結果Tab.6 Results of the repeatability test

中間精密度試驗：將5支陰性對照樣品和不同孔徑的陽性樣品各4支隨機混合，由不同試驗人員連續檢測2 d（D1，D2），記錄差壓值和絕壓值。結果中間精密度試驗的RSD均小于10%，表明方法中間精密度良好，能滿足樣品的密封完整性檢測。詳見表7。

表7 中間精密度試驗結果Tab.Results of the intermediate precision test

檢測限確定：由準確度和精密度試驗結果可知，本研究中建立的方法檢測限為3 μm。

大漏樣品測定：以裝有1 mL 勞拉西泮注射液但不軋蓋、密封的中硼硅玻璃管制注射劑瓶作為大漏樣品（孔徑為9 mm），對大漏樣品進行檢測，記錄泄露情況，泄漏記作“+”，未泄漏記作“-”。共測試5支大漏樣品，結果均泄漏，檢出率為100.00%，表明方法的檢測范圍較寬，即不小于3 μm。詳見表8。

表8 大漏樣品測定結果Tab.8 Detection results of large leakage samples

耐用性試驗：對表3 確定的檢測參數進行微調，測試陽性樣品和陰性對照樣品，記錄泄漏情況，泄漏記作“+”，未泄漏記作“-”。通過對測試壓力（真空度）、平衡時間（保壓時間）、測試時間進行微調，陰性對照樣品和不同孔徑陽性樣品檢出率均為100.00%，表明方法耐用性良好。詳見表9。

表9 耐用性試驗結果Tab.9 Results of the durability test

2.4 真空衰減法與微生物挑戰法比較

菌懸浮液制備：藥品包裝系統內外均為有氧環境，應選擇需氧菌作為微生物挑戰法測試的目標菌株［12-13］。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性需氧桿菌，菌長為1.5～3.0 μm、寬為0.5～0.8 μm，體積和尺寸均較小，易從漏孔侵入，故選擇銅綠假單胞菌作為目標菌株［14-15］。取銅綠假單胞菌ATCC 27853 適量，接種于10 mL無菌胰酪大豆胨液體培養基，35 ℃、180 r/min振蕩培養6 h，取少量菌液，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，采用菌落計數法進行計數，菌懸液濃度應不低于105cfu/mL［16］。

微生物侵入試驗：將陽性樣品（名義孔徑分別為3，5，10 μm）和陰性對照樣品完全浸泡在銅綠假單胞菌菌懸液中，置智能密封儀的壓力倉內，于負壓壓力-60 kPa、負壓時間5 min、正壓壓力+80 kPa、正壓時間10 min 的條件下進行微生物侵入試驗。侵菌試驗結束后，將陰性對照樣品和陽性樣品置35 ℃培養箱中培養14 d，逐日觀察并記錄。結果當陽性樣品名義孔徑分別為3，5，10 μm 時，微生物侵入率分別為70.00%，90.00%，100.00%；陰性對照樣品微生物侵入率為0。詳見表10。

表10 微生物挑戰法檢測結果Tab.10 Results of the microbiological challenge method

檢出率比較：真空衰減法和微生物挑戰法對勞拉西泮注射液包裝密封性檢出結果見圖2。結果表明，真空衰減法靈敏度較微生物挑戰法更高，更有利于確保勞拉西泮注射液的包裝密封性。

圖2 真空衰減法與微生物挑戰法檢出率比較Fig.2 Comparison of detection rates between the vacuum decay method and the microbial challenge method

2.5 加速試驗

采用勞拉西泮注射液（規格為每支1 mL∶2 mg，批號分別為SLZ220901，SLZ220902，SLZ220903）模擬市售包裝，進行3 個月的加速試驗，溫度為（40 ± 2）℃，相對濕度為（75±5）%。采用本研究中建立的真空衰減法檢測勞拉西泮注射液的包裝密封性，泄漏記作“+”，未泄漏記作“ -”。結果3 批樣品均未泄漏，表明市售勞拉西泮注射液（規格為每支1 mL∶2 mg）具有良好的密封完整性。詳見表11。

表11 加速試驗結果Tab.11 Results of the accelerated test

3 討論

本研究中參照USP 1207 和ASTM F2338 - 09 建立了測定勞拉西泮注射液包裝密封性的真空衰減法的檢測參數，即真空度5 mbar、保壓時間4.0 s（Cycle 1），真空度1.4 mbar、保壓時間3.0 s、測試時間16.0 s、泄壓時間4.0 s（Cycle 2）。采用該方法對陰性對照樣品進行多次檢測，確認泄漏閾值為絕壓P/F閾值436.8 mbar、差壓P/F閾值17.6 Pa。經測試，當陽性樣品名義孔徑為3 μm及以上時，真空衰減法檢出率均為100.0%。采用銅綠假單胞菌ATCC 27853 進行微生物挑戰試驗，經測試，當陽性樣品名義孔徑為3，5，10 μm 時，侵入率分別為70.00%，90.00%，100.00%。本研究中針對勞拉西泮注射液建立的真空衰減法靈敏度為3 μm，較微生物挑戰法的靈敏度更高，該方法可在不破壞產品及其包裝的基礎上有效保障勞拉西泮注射液的密封完整性，確保勞拉西泮注射液的質量符合要求，保障其在有效期內安全、可控，并為其他類似包裝的藥品檢測提供參考。