微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑的細胞滲透特性與損傷評估

劉林峰 崔夢冬 占太杰 何 偉 胥 義

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海市生物資源低溫保存技術(shù)服務(wù)平臺 上海市腫瘤能量治療技術(shù)與器械協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 200093)

細胞低溫保存在生殖醫(yī)學(xué)、細胞治療和生物樣本庫建設(shè)等領(lǐng)域具有重要意義[1-5]。目前常用的低溫保存方法均需進行低溫保護劑加載,以減小冰晶對細胞造成的損傷[6-7]。但加載高濃度低溫保護劑會使細胞外滲透壓發(fā)生較大變化,引起細胞體積急劇收縮,從而造成滲透損傷,并且高濃度低溫保護劑本身可能會對細胞造成毒性損傷[8-13]。為減少低溫保護劑帶來的細胞損傷,通常采用分步加載或連續(xù)加載低溫保護劑的方法[14-15]。早在1998年,I. I. Katkov等[16]就使用分步加載高濃度甘油的方法成功提升了低溫保存后的小鼠精子活力[16]。但隨著研究的深入,分步加載逐漸暴露出操作繁瑣和細胞丟失等問題[17]。為彌補分步加載的不足,學(xué)者們提出連續(xù)加載低溫保護劑的方法,并引進微流控技術(shù)以實現(xiàn)低溫保護劑濃度的精準控制[18]。微流控技術(shù)可以使低溫保護劑濃度變化呈現(xiàn)線性甚至更復(fù)雜的曲線,進一步降低了低溫保護劑加載過程的細胞損傷[19-23]。但微流控芯片設(shè)計復(fù)雜,需要特定的操作設(shè)備與操作環(huán)境,仍具有較大局限性[24]。由此看來,有必要開發(fā)新的低溫保護劑加載方法,在降低細胞損傷的同時實現(xiàn)加載流程的簡化。

近年來,微液滴法被認為是一種有效的低溫保存方法,廣泛用于細胞低溫保存[25-27]。本文提出基于微液滴自然蒸發(fā)的低溫保護劑加載方法,利用微液滴自然蒸發(fā)濃縮原理,實現(xiàn)初始低濃度低溫保護劑連續(xù)加載的目的。借助圖像處理技術(shù),結(jié)合細胞滲透與損傷模型理論分析,系統(tǒng)研究了體積和初始濃度對微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑過程的細胞滲透特性與損傷的影響,并與傳統(tǒng)低溫保護劑加載方法(一步加載、兩步加載)進行對比,有望在簡化低溫保護劑加載流程的同時有效降低細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與實驗材料

儀器:恒溫恒濕箱(恒諾利興,SPX-50B)、光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯,ix-81)、細胞培養(yǎng)箱(普和希,MCO-18AC)、細胞計數(shù)儀(博大博聚,JSY-SC-031N)。

材料:DMEM培養(yǎng)基(Gobic)、胎牛血清(FBS,GEMINI)、青霉素/鏈霉素(Gibco)、吖啶橙/碘化丙啶染色劑(AO/PI,Nexcelom)、磷酸鹽緩沖液(PBS,TBD)、二甲基亞砜(DMSO, Solarbio)、氯化鈉(NaCl,SCR)。

實驗所用低溫保護劑溶液均用DMSO和PBS配制。實驗細胞為A549,將細胞放入完全培養(yǎng)基(體積分數(shù)為74%的DMEM、體積分數(shù)為15%的胎牛血清、體積分數(shù)為1%的青霉素/鏈霉素)中,在37 ℃和CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞成熟后,進行消化離心重懸,配制4×105cells/mL細胞懸液。

1.2 低溫保護劑微液滴自然蒸發(fā)過程的濃度預(yù)測模型

本研究采用F. Sch?nfeld等[28]對固著液滴蒸發(fā)過程中液滴體積隨時間的非線性預(yù)測公式:

(1)

(2)

式中:V為液滴體積,m3;V0為液滴初始體積,m3;t為蒸發(fā)時間,s;τ0為蒸發(fā)時間的相對誤差,s;a、δ為無量綱因子;D為蒸氣分子在空氣中的擴散系數(shù),m2/s;Δp為液滴的飽和蒸氣壓和遠離液滴表面的蒸氣壓之間的壓力差,Pa;M為摩爾質(zhì)量,kg/mol;ρ為液體密度,kg/m3;R為氣體常數(shù),J/(mol·K);T為溫度,K。

由于DMSO沸點高于水,蒸發(fā)過程近似認為水先擴散至大氣中[29],因此可得到低溫保護劑濃度與體積關(guān)系式(本文出現(xiàn)的濃度均為物質(zhì)的量濃度):

(3)

式中:C為低溫保護劑濃度,M;C0為低溫保護劑初始濃度,M。全文出現(xiàn)的所有M均表示mol/L。

式(1)～式(3)聯(lián)立可得液滴濃度預(yù)測公式:

(4)

由于表面張力和馬蘭戈尼效應(yīng)等作用,可能會導(dǎo)致液滴蒸發(fā)過程中的溶質(zhì)濃度分布不均勻,但并不影響微液滴低溫保存過程[30],因此本研究近似認為液滴內(nèi)部濃度是均勻的。

1.3 液滴與細胞體積計算方法

分別通過工業(yè)相機和光學(xué)顯微鏡采集實驗過程中的液滴與細胞圖片,利用Image J軟件處理,可得到液滴接觸半徑、液滴接觸角和細胞二維投影面積等參數(shù)。假設(shè)液滴為標準球冠,液滴體積的計算如下[31]:

(5)

式中:r為接觸半徑,m;θ為接觸角,rad。

假設(shè)細胞為理想球體,細胞投影面積與體積的關(guān)系[32]:

(6)

式中:Ac為細胞投影面積,m2;Vc為細胞體積,m3;Aiso為細胞在等滲溶液中的投影面積,m2;Viso為細胞在等滲溶液中的體積,一般取細胞的初始體積,m3。

1.4 細胞滲透特性研究方法

1.4.1 滲透模型

利用MATLAB對三參數(shù)模型(K-K模型)進行求解,分析不同加載方案過程的細胞體積與胞內(nèi)低溫保護劑變化[33]:

(7)

(8)

(9)

(10)

式中:A為細胞表面積,m2;Jcpa為CPA通量,m3/(m2·s);Jw為水通量,m3/(m2·s);Lp為水的膜滲透率,m3/(N·s);ncpa為細胞內(nèi)保護劑含量,mol;Vcpa為DMSO的摩爾體積,m3/mol;σ為細胞膜反射系數(shù);ω為保護劑的膜滲透率,mol/(N·s);下標1、2分別為細胞外、內(nèi);下標s、c分別為鹽、保護劑。

1.4.2 細胞非滲透體積(Vb)與膜滲透參數(shù)(Lp、ω、σ)的測定

用完全培養(yǎng)基和NaCl配制滲透壓為334、568.3、784.7、994.7、1 213、1 479.7、1 678 mOsm的溶液,分別與A549細胞混合,用光學(xué)顯微鏡的圖像采集系統(tǒng)記錄細胞體積變化,直至達到滲透平衡。其最終的滲透體積Veq可以表述為Boyle van′t Hoff關(guān)系式[34]:

(11)

式中:Vb為細胞非滲透體積,m3;miso為滲透壓,mOsm;m為實時滲透壓,mOsm;Veq為細胞在滲透壓為m的溶液中的平衡體積,μm3;細胞的相對體積Veq/Viso與溶液的實時滲透壓的倒數(shù)1/m呈線性關(guān)系,將實驗數(shù)據(jù)作圖并進行線性擬合,可以得到直線在y軸的截距,即細胞的非滲透體積比Vb/Viso。

用完全培養(yǎng)基配制2 M的DMSO溶液,在溶液溫度為4 ℃條件下與A549細胞混合,并用光學(xué)顯微鏡的圖像采集系統(tǒng)記錄細胞體積變化,直至細胞滲透平衡。利用MATLAB對三參數(shù)模型(K-K模型)擬合回歸的方法測定細胞膜滲透參數(shù)。

1.5 細胞損傷評估方法

利用MATLAB計算累積滲透損傷值A(chǔ)OD與累積毒性損傷值J,并結(jié)合細胞體積變化極值ΔV評估低溫保護劑加載過程中的細胞損傷[35-37]。

1.5.1 累積滲透損傷模型

(12)

式中:Vc-Viso為細胞體積的變化值,μm3。AOD的計算包含從加載開始至加載結(jié)束整個過程中細胞體積的變化,即細胞體積膨脹和收縮造成的滲透損傷。

1.5.2 累積毒性損傷模型

(13)

1.5.3 細胞存活與增殖

采用不同方案對A549細胞進行低溫保護劑加載后,使用AO/PI染色劑評估細胞活力。DNA染色的正常細胞被吖啶橙染成均勻的綠色,而壞死的細胞則顯示出強烈的紅色熒光。將一部分加載結(jié)束的細胞放置于含有完全培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)48 h,用顯微鏡觀察細胞貼壁情況,以此判斷其增殖能力。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 低溫保護劑微液滴自然蒸發(fā)過程的濃度變化

如圖1(a)所示,在環(huán)境溫度為4 ℃,環(huán)境濕度為30%的工況下,低溫保護劑液滴以恒接觸半徑模式蒸發(fā),隨著時間增加,液滴接觸角逐漸減小。根據(jù)式(5)計算得到每個時刻的液滴體積,并與式(1)、式(2)計算得到的預(yù)測數(shù)據(jù)對比,結(jié)果如圖1(b)所示,實驗得到的液滴體積數(shù)據(jù)與預(yù)測數(shù)據(jù)基本一致。根據(jù)式(3)計算得到的液滴濃度如圖1(c)所示,該結(jié)果與式(4)計算得到的預(yù)測數(shù)據(jù)吻合,證明該預(yù)測模型具有可行性。

圖1 DMSO微液滴濃度變化預(yù)測

根據(jù)式(4)對不同體積液滴的保護劑濃度變化進行預(yù)測,結(jié)果如圖1(d)所示,隨著液滴體積的增大,液滴濃度增加速率逐漸減慢。將目標濃度設(shè)置為5 M[38],在相同初始濃度條件下,1 μL液滴加載至目標濃度的時間較5 μL縮短4 907 s。這是由于隨著液滴體積的增大,其所具有的吉布斯自由能越小,更不易在較低溫度下蒸發(fā)[39]。因此,1 μL液滴更適用于微液滴自然蒸發(fā)加載,可有效減少低溫保護劑加載時間。而對于不同初始保護劑濃度的液滴蒸發(fā)情況如圖1(e)所示,初始濃度為0.5～2.5 M的1 μL DMSO液滴加載至目標濃度所需時間分別為2 260、1 962、1 678、1 406、1 146 s。綜上可知,隨著初始濃度的增加,達到目標保護劑濃度的所需時間會逐漸縮短。這是由于液滴蒸發(fā)速率固定,初始低溫保護劑濃度越高,與目標濃度的差值越小,最終蒸發(fā)時間也會減少。

2.2 微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑過程的細胞滲透特性

微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑過程如圖2所示。初始狀態(tài)下,細胞在較低濃度的保護劑中達到平衡,隨著微液滴中水分的自然蒸發(fā),低溫保護劑濃度逐漸提高至目標濃度。蒸發(fā)結(jié)束時,胞內(nèi)低溫保護劑濃度可達到較高水平,成功實現(xiàn)了低溫保護劑的加載。本研究借助圖像處理技術(shù),結(jié)合細胞滲透模型對微液滴自然蒸發(fā)加載過程的細胞滲透特性進行了研究。

圖2 微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑示意圖

2.2.1 細胞非滲透體積(Vb)與膜滲透參數(shù)(Lp、ω、σ)的確定

將初始細胞體積默認為等滲體積,測定細胞在不同滲透環(huán)境中平衡后的體積,得到A549細胞體積隨滲透壓變化的規(guī)律,如圖3(a)所示。采用最小二乘法線性擬合,得到Boyle van′t Hoff曲線,并且外延至無限大濃度,即圖3(a)中y軸截距位置,可以得到細胞的非滲透體積Vb=0.22Viso,其擬合系數(shù)R2=0.956 82。

圖3 A549細胞非滲透體積與滲透參數(shù)實驗曲線

圖3(b)所示為加入2 M DMSO后的細胞體積變化數(shù)據(jù)。細胞在4 s時會達到滲透極值,約為初始體積的60%,隨時間的增加,逐漸恢復(fù)至初始狀態(tài)。這是由于在滲透壓差的作用下,水分會通過細胞膜流出細胞,而DMSO會進入細胞,但水的滲透速率大于DMSO,導(dǎo)致細胞皺縮,當(dāng)其滲透平衡時達到滲透極值,之后隨著DMSO和水同時向胞內(nèi)滲透,細胞逐漸恢復(fù)至原來的體積[40]。利用MATLAB軟件對K-K模型進行計算,并對比計算結(jié)果與實驗值,直至方差最小,最終可得到水的膜滲透率Lp、DMSO的膜滲透率ω和反射系數(shù)σ,如表1所示。

表1 環(huán)境溫度為4 ℃時A549在DMSO溶液中的滲透參數(shù)

2.2.2 微液滴自然蒸發(fā)加載過程的細胞滲透特性

在環(huán)境溫度為4 ℃,環(huán)境濕度為30%的條件下,對微液滴自然蒸發(fā)加載過程的細胞滲透特性進行計算分析。加載方案如圖4(a)所示,將細胞分別置于濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 M的低溫保護劑溶液中平衡200 s,然后取1 μL微液滴進行自然蒸發(fā),隨著時間增加,保護劑濃度升高,直至5 M的目標濃度,最終加載時間分別為2 460、2 162、1 878、1 606、1 346 s。

圖4 不同初始濃度保護劑微液滴自然蒸發(fā)加載的細胞滲透過程

細胞體積的變化如圖4(b)所示。在最初平衡期間,由于外部滲透壓突然增加,細胞脫水皺縮,達到滲透平衡之后,體積逐漸恢復(fù)。細胞皺縮程度與初始保護劑濃度有關(guān),初始保護劑濃度越高,胞外滲透壓越高,皺縮程度也就越大。平衡200 s后,自然蒸發(fā)開始,此時細胞會由于胞外滲透壓的升高而逐漸失水皺縮,直至加載結(jié)束。整個加載過程中的細胞體積變化極值僅在最初平衡階段產(chǎn)生,不同初始保護劑濃度液滴所對應(yīng)的細胞體積變化極值為:ΔV0.5 M<ΔV1 M<ΔV1.5 M<ΔV2 M<ΔV2.5 M,即隨著初始保護劑濃度的升高,細胞體積變化極值逐漸增大,但均未超過初始體積的1/2,ΔV0.5 M其中僅為初始體積的14%。一般細胞體積變化極值越小意味著低溫保護劑加載過程中細胞受到的滲透損傷越小[41]。胞內(nèi)低溫保護劑的加載情況如圖4(c)所示,在200 s平衡期間,細胞內(nèi)的保護劑濃度快速增加,直至滲透平衡。微液滴自然蒸發(fā)開始以后,胞內(nèi)保護劑濃度會隨著胞外保護劑濃度的升高而逐漸增加,直至胞外達到目標濃度。最終所用加載時間隨著初始保護劑濃度的降低而逐漸延長。綜上所述,在微液滴自然蒸發(fā)加載過程中,初始低溫保護劑濃度的降低會減小細胞的體積變化極值,降低細胞滲透損傷,但胞內(nèi)保護劑加載速率減慢,導(dǎo)致加載時間延長。

2.2.3 微液滴自然蒸發(fā)加載與傳統(tǒng)加載過程的細胞滲透特性對比分析

如圖5(a)所示,本研究中傳統(tǒng)加載方案選用一步加載和兩步加載,低溫保護劑的目標濃度均設(shè)置為5 M。一步加載:將細胞置于5 M的低溫保護劑溶液中平衡600 s;兩步加載:先將細胞置于2.5 M的低溫保護劑溶液中平衡600 s,再將細胞轉(zhuǎn)移至5 M的低溫保護劑溶液中平衡600 s;微液滴自然蒸發(fā)加載則選取低溫保護劑初始濃度為0.5 M的加載方案。

圖5 不同低溫保護劑加載方案的細胞滲透過程

細胞體積變化如圖5(b)所示。一步加載會導(dǎo)致細胞劇烈皺縮,體積變化極值高達初始體積的57%,可能會對細胞造成不可逆的損傷[42]。兩步加載有兩個相對較小的皺縮過程,且細胞體積變化極值小于一步加載,為初始體積的43%。微液滴自然蒸發(fā)加載則僅在初始200 s平衡期間有一個更小的細胞皺縮過程,細胞體積變化極值遠小于一步加載與兩步加載,僅為初始體積的14%。這是由于微液滴自然蒸發(fā)加載的低初始保護劑濃度會顯著減小細胞內(nèi)外的滲透壓差,從而減緩細胞皺縮。胞內(nèi)保護劑濃度變化如圖5(c)所示。一步加載和兩步加載在添加低溫保護劑時,胞內(nèi)保護劑濃度快速上升,直至滲透平衡。而微液滴自然蒸發(fā)加載僅在初始平衡階段有小幅度的濃度上升,蒸發(fā)開始之后,胞內(nèi)保護劑濃度平穩(wěn)上升,直至加載結(jié)束。但微液滴自然蒸發(fā)加載結(jié)束所需時間為2 260 s,大于一步加載的600 s和兩步加載的1 200 s,可能會對細胞造成毒性損傷。因此,相比于傳統(tǒng)加載方法,微液滴自然蒸發(fā)加載可顯著降低細胞體積的變化極值,但加載時間較長,仍需優(yōu)化改進。

2.3 微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑過程的細胞損傷

2.3.1 微液滴自然蒸發(fā)加載過程的細胞損傷評估

細胞累積滲透損傷AOD變化如圖6(a)所示。在200 s平衡階段,由于細胞體積的劇烈變化,其所受到的累積滲透損傷快速升高,后續(xù)蒸發(fā)加載開始,體積變化程度減小,累積滲透損傷增加速率減慢,直至加載結(jié)束。雖然不同方案造成的細胞體積變化程度不同,但在加載結(jié)束后,細胞所受到的累積滲透損傷接近,均在36.5～39.0之間。這是由于加載時間不同導(dǎo)致的,隨著時間的增長,累積滲透損傷也會越大。而累積毒性損傷J變化如圖6(b)所示。變化速率與初始保護劑濃度相關(guān),初始濃度越高其變化速率越快。加載結(jié)束后,累積毒性損傷結(jié)果為:J0.5 M

圖6 不同初始濃度低溫保護劑微液滴自然蒸發(fā)加載的細胞損傷

相同條件下的細胞實驗結(jié)果如圖6(c)、6(d)所示。不同加載方案的細胞存活率均在95%以上,與新鮮組無顯著差異(P>0.05)。但初始保護劑濃度較高的方案在后續(xù)培養(yǎng)48 h后,細胞貼壁情況變差,增殖能力顯著降低,這與累積毒性損傷計算結(jié)果一致。因此,初始保護劑濃度較低的微液滴自然蒸發(fā)加載方案可顯著降低細胞損傷,提高細胞的增殖能力。

2.3.2 微液滴自然蒸發(fā)加載與傳統(tǒng)加載方法的細胞損傷對比分析

為進一步研究微液滴自然蒸發(fā)加載與傳統(tǒng)低溫保護劑加載方法造成的細胞損傷差異,采用圖5(a)中的加載方案對其進行評估。細胞累積滲透損傷AOD變化如圖7(a)所示,兩步加載和蒸發(fā)加載結(jié)束后的AOD分別為37和36.8,均略高于一步加載。雖然微液滴自然蒸發(fā)加載的細胞體積變化極值遠小于一步加載和兩步加載,但體積變化時間均相對較長,會導(dǎo)致累積滲透損傷的增加。細胞累計毒性損傷變化如圖7(b)所示,微液滴自然蒸發(fā)加載累積滲透損傷J值僅為23.05,遠小于兩種傳統(tǒng)加載方法。這是由于微液滴自然蒸發(fā)加載具有較小的初始保護劑濃度,且在整個加載過程中保護劑濃度增加速率較慢,只會對細胞造成較小的毒性損傷。

圖7 不同保護劑加載方案的細胞損傷

相同條件下的細胞實驗結(jié)果如圖7(c)、7(d)所示。一步加載組的細胞存活率僅為81.24%±0.53%,顯著低于兩步加載組與微液滴自然蒸發(fā)加載組(P<0.05)。可能是由于一步加載中的細胞體積變化極值超過初始體積的1/2,對細胞造成了不可逆的損傷[42]。而兩步加載組、蒸發(fā)加載組均與新鮮組無顯著差異(P>0.05),均高于95%。細胞的后續(xù)增殖情況如圖7(d)所示,兩步加載組的細胞在培養(yǎng)48 h后,貼壁情況較差,細胞增殖能力相比自然蒸發(fā)加載組顯著降低,這與細胞累積毒性損傷結(jié)果一致。因此,微液滴自然蒸發(fā)加載方法相比傳統(tǒng)加載方法具有顯著優(yōu)勢,能夠有效降低細胞損傷,顯著提高細胞存活率與細胞增殖能力。

3 結(jié)論

本文提出一種微液滴自然蒸發(fā)加載低溫保護劑的方法,并與傳統(tǒng)低溫保護劑加載方法(一步加載、兩步加載)進行對比分析。得到如下結(jié)論:

1)微液滴自然蒸發(fā)加載更適用于小體積的低溫保護劑液滴,隨著液滴體積的減小,蒸發(fā)速率逐漸加快,低溫保護劑更易達到目標濃度,能夠有效縮短加載時間,其中1 μL液滴比5 μL可縮短4 907 s。

2)微液滴自然蒸發(fā)加載過程的細胞滲透特性與細胞損傷均受到初始低溫保護劑濃度影響,降低初始保護劑濃度能夠有效減小細胞滲透過程中的體積變化極值,且可以降低細胞毒性損傷,顯著提高細胞增殖能力。在不同初始保護劑濃度的加載方案中,0.5 M組的細胞體積變化極值僅為初始體積的14%,且細胞累積毒性損傷比2.5 M組降低52%。

3)與傳統(tǒng)保護劑加載方法相比,微液滴自然蒸發(fā)加載不僅能夠?qū)⒓毎w積變化極值由初始體積的57%降至14%,而且可顯著降低細胞毒性損傷,有效提高細胞存活率與增殖能力。微液滴自然蒸發(fā)加載方案的細胞存活率比一步加載可提升16%,且培養(yǎng)48 h后的細胞增殖能力顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法。但該方法整體加載時間過長,后續(xù)仍需優(yōu)化。