基于網(wǎng)絡藥理學探討“運脾法”治療兒童腺樣體肥大的機制及實驗驗證

張奕星,林 燕,楊 銘,姜之炎

(1.麗水市中醫(yī)院兒科,浙江 麗水 323000;上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 2.兒科、3.GCP中心,上海 200030)

腺樣體是兒童時期重要的免疫器官之一,也是兒童呼吸道第一道防線。生理性腺樣體肥大常于2～6 歲時出現(xiàn),5～8歲達峰值,后逐漸自然萎縮[1]。若外界病原體入侵人體,引起腺樣體淋巴組織增生,即腺樣體肥大(adenoidal hypertrophy,AH),可誘發(fā)鼻塞、張口呼吸、夜眠打鼾等臨床癥狀,長期易導致阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)及腺樣體面容,甚至影響肺、心、腦等組織器官的正常功能活動[2]。有研究[3]表明,在隨機代表性樣本中兒童和青少年AH的臨床患病率達34.46%,故AH受到越來越多臨床醫(yī)生及家長的關注。對AH的治療,西醫(yī)以局部應用鼻用激素進行抗炎或手術切除治療為主,有一定副作用及手術風險,中醫(yī)則基于兒童生理病理特點及疾病發(fā)展規(guī)律進行辨證論治。本病屬于呼吸道疾病,在五臟中屬肺,但病位在鼻,鼻居土位而屬脾,且脾肺為母子之臟,在氣的生成運行及水液代謝方面相輔相依。上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院姜之炎教授認為痰是兒童AH的主要致病因素,而痰的產生、凝聚和消散均與脾的功能息息相關,脾病濕勝為“痰”之本源,故治痰多從治脾入手,提出“運脾治鼻”新觀念,創(chuàng)“運脾化痰通竅方”治療兒童AH,方中以蒼術燥濕運脾,薏苡仁健脾滲濕,共為君藥,在臨床上取得滿意療效[4],但對“運脾治鼻”的作用機制還未進行系統(tǒng)的研究。

網(wǎng)絡藥理學是研究中藥復方多成分、多靶點作用機制的有效方法之一,其整體性、系統(tǒng)性、聯(lián)系性的特點與中醫(yī)整體觀念、辨證論治及動態(tài)觀思維相一致[5],借助醫(yī)學、生物信息學、計算機科學等多學科為研究手段,通過整合多種生物數(shù)據(jù)庫,構建“成分-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡,能系統(tǒng)綜合地反映中藥或中藥復方的可能作用機制,是探索中藥藥理的有效的方法。因此,本項研究借助網(wǎng)絡藥理學方法,分析運脾化痰通絡方中君藥“蒼術-薏苡仁”的有效成分及治療靶點,以探討“運脾法”治療兒童AH的可能機制,同時通過實驗對核心靶點進行驗證,以期為中醫(yī)藥治療兒童AH提供新的科學依據(jù)。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件Database name URL:1.TCMSP https://tcmspw.com/tcmspsearch.php;2.TCMID http://www.megabionet.org/tcmid/;3.BATMAN-TCM http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/;4.PubChem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/;5.UniProt https://www.uniprot.org/;6.OMIM https://www.omim.org/;7.GeneCards https://www.genecards.org/;8.DurgBank https://go.drugbank.com/;9.DisGeNET https://www.disgenet.org/;10.Venny https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/;11.STRING https://string-db.org/;12.Metascape https://metascape.org/;13.Bioinformatics http://www.bioinformatics.com.cn/。

1.2 實驗動物SPF級雄性BALB/c小鼠30 只,體質量(20～25) g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,SCXK(滬)2017-0005,適應性喂養(yǎng)1周,飼養(yǎng)于SPF級層流實驗室,飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(22±1)℃,濕度保持在65%～70%,12 h明/暗光照周期,可自由飲水。實驗動物飼養(yǎng)及觀察于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院進行,操作符合上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院動物倫理委員會的相關審批(No 2018082306A),所有的外科手術過程都是在麻醉下進行的,并盡一切努力盡量減少痛苦。

1.3 藥物與試劑中藥蒼術由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房提供并進行蒼術酮的分離與提取;HIF-1α多克隆抗體(英國Abcam,ab16066);VEGF多克隆抗體(英國Abcam,ab11934);VEGF-R多克隆抗體(美國Proteintech,13687-1-AP);SUMO-1多克隆抗體(美國Proteintech,10329-1-AP);封閉液(英國Abcam,ab216327);羊抗兔HRP標記二抗(碧云天,A0208);羊抗鼠HRP標記二抗(碧云天,A0216);RIPA組織細胞快速裂解液(上海基爾頓生物,BYL40825);BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo,PICPI23223);30%丙烯酰胺(29 ∶1,上海基爾頓生物,BYL40857);1.0 mol·L-1Tris-HCl,pH 8.8電泳緩沖液(上海基爾頓生物,BYL40910);1.0 mol·L-1Tris-HCl,pH 6.8電泳緩沖液(上海基爾頓生物,BYL40908);TEMED(上海基爾頓生物,BYL40728);4×蛋白上樣緩沖液(上海基爾頓生物,BYL40828)蛋白預染Marker(加拿大Fermentas,SM1811);麗春紅S(上海基爾頓生物,BYL40635);Tween-20(美國Amresco,BYL40713);NC膜(德國millipore,HATF00010);發(fā)光液(德國Millipore,WBKLS0100);10%SDS(上海基爾頓生物,BYL40944);10%過硫酸銨(上海基爾頓生物,BYL40856);其余試劑如PBS緩沖液、脫脂奶粉等由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中心實驗室提供。

1.4 儀器超臨界液體萃取儀(沃特世科技(上海)有限公司,型號SFE),小型垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司,型號mini protean 3 cell);多功能酶標儀(美國Bio Tek公司,Synergy2型);電轉儀(大連競邁科技有限公司,型號PS-9);恒溫水浴鍋(瑞士萊卡公司,型號HI1210);全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)凝膠成像儀(天能,型號Tanon-5200)。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡藥理學

2.1.1“蒼術-薏苡仁”活性成分篩選及相關靶點預測 以“蒼術”、“薏苡仁”為關鍵詞,通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(TCMSP)、中醫(yī)綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)及中醫(yī)藥分子機制生物信息學分析平臺(BATAMAN-TCM)等進行檢索,得到藥物的主要化學成分,根據(jù)藥代動力學(ADME)參數(shù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18、P<0.05、Scorecutoff>20 為標準進行篩選[6],并參考相關文獻補充未收錄于數(shù)據(jù)庫的相關有效成分,利用有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem)[7]根據(jù)其3D分子結構,在DTPS靶點預測系統(tǒng)中查找可能靶點,最終獲得“蒼術-薏苡仁”中具有較高活性的有效化學成分及其作用靶點。篩選結束后,通過全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫(Uniprot)對上述靶蛋白基因名進行標準化,去除重復數(shù)據(jù)后得到最終的靶點信息。

2.1.2構建運脾化痰通竅方“藥物-成分-靶點”可視化網(wǎng)絡圖 運用Cytoscape 3.9.1軟件構建運脾化痰通竅方“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡,其中“節(jié)點(node)”為中藥、活性成分及作用靶點,“邊(edge)”表示各節(jié)點間相互作用的關系,“度(degree)”代表與之連接邊的數(shù)目,節(jié)點度值越大說明節(jié)點在網(wǎng)絡中越重要。利用Cytoscape軟件中“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析,探索藥物活性成分與靶點之間的關系。

2.1.3兒童AH相關靶點檢索 通過人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(OMIM)、基因數(shù)據(jù)庫(Gene Cards)、藥物數(shù)據(jù)庫(Drug Bank)及疾病相關的基因及突變位點數(shù)據(jù)庫(DisGeNET),以“adenoid hypertrophy”、“adenoid vegetation”作為關鍵詞分別進行檢索,在Genecards 數(shù)據(jù)庫中,根據(jù)經(jīng)驗設定Score大于中位數(shù)的目標靶點為AH的潛在靶點,合并幾個數(shù)據(jù)庫篩選結果后剔除相同靶點,獲得與AH相關靶點信息,同樣使用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范。最運將AH疾病相關靶點和“蒼術-薏苡仁”藥對相關靶點取交集,繪制韋恩圖,得到“疾病-藥物”交集靶點。

2.1.4“蒼術-薏苡仁”藥對治療兒童AH的PPI網(wǎng)絡構建 為明確運脾化痰通竅方中君藥“蒼術-薏苡仁”相關靶點與AH疾病靶點之間的相互作用,將繪制韋恩圖后得到的交集靶點蛋白提交入STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,并將結果導入Cytoscape 3.9.1軟件進行進一步分析。

2.1.5“蒼術-薏苡仁”藥對治療兒童AH核心靶點的富集分析 將“蒼術-薏苡仁”治療兒童AH的核心靶點錄入Metascape數(shù)據(jù)平臺[8],物種選擇“H. sapiens”,設置P<0.01后進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC),以了解核心靶點主要的生物學過程與相關信號通路。并通過“微生信”在線平臺對分析結果進行可視化。

2.1.6構建“蒼術-薏苡仁”藥對治療兒童AH的“靶點-通路”可視化網(wǎng)絡圖 將富集到的通路信息導入Cytoscape 3.9.1軟件進行“靶點-通路”網(wǎng)絡的構建,并利用軟件中“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析,最終構建靶點與通路之間的關系圖。

2.2 動物實驗

2.2.1分組及給藥 適應性喂養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表將30 只BALB/c小鼠分為對照組、模型組、治療組(低、中、高劑量組),共5 組,每組各6 只。除對照組外其余各組予LPS處理后低氧環(huán)境下培養(yǎng)28 d,即使用Hycon系統(tǒng)調節(jié)空氣/氮氣輸送,90 s 6.1%的O2與N2與90 s 21% O2(室內空氣)在照明階段交替12 h,夜間氧濃度維持在21%。造模結束后,治療組予蒼術酮干預,低、中、高劑量組分別給予蒼術酮10、20、40 mg·kg-1,采用灌胃給藥,每天1 次,連續(xù)28 d,對照組與模型組予等體積純水灌胃處理。

2.2.2標本采集 療程結束后以戊巴比妥鈉30 mg·kg-1腹腔注射麻醉小鼠,取脾組織,剪成細小的碎片,按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液,勻漿器勻漿直至完全裂解,4 ℃ 12 000g離心15 min,取上清,使用BCA試劑盒進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱備用。

2.2.3Western blot法檢測脾組織中相關蛋白表達 根據(jù)目的蛋白的分子量(SUMO-1 12 ku、HIF-1α 120 ku、VEGFA 43 ku、VEGF-R 151 ku)選擇不同的凝膠濃度以配制分離膠,不同組的蛋白質提取物經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂牛奶封閉后,與相應的一抗在4 ℃下孵育過夜。樣品與一抗孵育后,與二抗孵育,隨后,使用電化學發(fā)光系統(tǒng)清洗可視化膜,使用凝膠軟件分析蛋白帶密度。以β-actin作為加載對照。

3 結果

3.1 “蒼術-薏苡仁”成分及靶點獲取經(jīng)查找篩選,最終得到蒼術有效化學成分4 種,分別為漢黃芩素、柱頭甾醇、蒼術酮、β-胡蘿卜苷,薏苡仁有效化學成分5 種,分別為2-油酸甘油單酯、膽固醇、亞油酸乙酯、谷甾醇及豆甾醇。將有效成分進行編號,具體見Tab 1。有效成分根據(jù)ADME參數(shù)預測靶點,蒼術作用靶點57 個,薏苡仁作用靶點30 個,將靶點經(jīng)Uniprot統(tǒng)一校正并去重后,共獲得“蒼術-薏苡仁”藥對相關靶點71個。

Tab 1 Basic information on effective chemical composition of “Cangzhu-Yiyiren”

3.2 “蒼術-薏苡仁”藥對“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡構建和分析通過 Cytoscape 3.9.1軟件構建“藥物-成分-靶點”的網(wǎng)絡關系圖,共有82節(jié)點,包含蒼術、薏苡仁2 種中藥(以圓形表示),9 種活性成分(以六邊形表示)和篩選得到的71 個靶點(以方形表示)與118 條關系,見Fig 1。

Fig 1 The “Drug-component-target” network map

3.3 兒童AH相關靶點檢索從Genecards數(shù)據(jù)庫以“adenoid hypertrophy”作為關鍵詞檢索到疾病靶點851 個,以“adenoid vegetation”作為關鍵詞檢索到疾病靶點518 個。根據(jù)經(jīng)驗設定Score大于中位數(shù)的目標靶點為AH的潛在靶點,故分別設Score>6.56和Score>3.82的靶點作為兒童AH的潛在靶點,進一步結合OMIM、DurgBank等數(shù)據(jù)庫結果,合并并刪除重復靶點,最終得到AH相關靶點337 個,繪制韋恩圖,見Fig 2,可得出“藥物-疾病”交集靶點30 個。

Fig 2 Venny of “Drug-disease” targets

3.4 “蒼術-薏苡仁”藥對治療兒童AH的PPI網(wǎng)絡構建將“藥物-疾病”交集靶點導入STRING庫,得到30 個核心蛋白的 PPI網(wǎng)絡圖,如Fig 3。并將 PPI 結果導入 Cytoscape 軟件中進行拓撲分析,共得到30 個節(jié)點,298 條邊,并根據(jù)各基因靶點度值(Degree)評估最核心靶點,面積越大、顏色越深說明該節(jié)點度值越高,見Fig 4。

Fig 3 PPI network of “Cangzhu-Yiyiren” for pediatric AH

Fig 4 The core genes of “Cangzhu-Yiyiren”

Fig 5 The bar diagram of GO enrichment analysis of treatment in AH by “Cangzhu-Yiyiren”

3.5 “蒼術-薏苡仁”治療兒童AH靶點功能與通路的富集分析應用Metascape平臺對核心靶點進行富集分析,并借助微生信在線作圖工具進行可視化輸出。將GO富集分析(BP、CC、MF)繪制條狀圖,橫坐標代表富集的名稱、縱坐標以-Log10(P)的值體現(xiàn)富集的大小,值越大代表本條信號通路越富集,如Fig 5所示,“蒼術-薏苡仁”藥對主要參與的生物學過程有管形態(tài)形成(tube morphogenesis)、對激素的反映(response to hormone)、對含氧水平下降的反映(response to decreased oxygen levels)等,運脾藥對治療AH主要涉及的細胞成分有膜筏(membrane raft)、轉錄調節(jié)因子復合物(transcription regulator complex)、轉錄抑制因子復合物(transcription repressor complex)等,相關靶點調治AH的功能主要富集于轉錄因子結合(transcription factor binding)、蛋白質結構域特異性結合(protein domain specific binding)、蛋白激酶結合(protein kinase binding)等。

KEGG通路富集分析繪制氣泡圖,其中橫坐標代表富集的大小,縱坐標代表富集的通路,氣泡大小提示該通路的基因數(shù),氣泡顏色由綠至紅代表-Log10P由小至大,和P值呈負相關,見Fig 6,由結果可見多個靶點的功能與兒童AH的產生密不可分,參與的通路主要與炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等相關,如多種細胞凋亡、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等。

Fig 6 The bubble analysis of KEGG enrichment analysis

3.6 “蒼術-薏苡仁”藥對治療兒童AH“靶點-通路”可視化網(wǎng)絡圖將在Metascape平臺富集到的18條通路信息導入 Cytoscape 3.9.1軟件,繪制“靶點-通路”網(wǎng)絡圖,紅色圓形為通路,按富集到此通路的基因靶點數(shù)量的多少進行排列,綠色長方形代表基因靶點,顏色越深則說明此基因靶點參與的通路越多,見Fig 7。

Fig 7 The bubble analysis of “Targets-pathways”

3.7 驗證蒼術酮通過HIF-1α-SUMOylation 調節(jié)炎癥因子的表達采用Western blot法檢測脾組織中相關蛋白表達,結果顯示,模型組SUMO-1、HIF-1α、VEGF及VEGF-R蛋白表達量均較對照組上調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各治療組目標蛋白表達均有不同程度下調,其下調程度與蒼術酮濃度相關,高劑量治療組SUMO-1、HIF-1α、VEGF及VEGF-R蛋白表達量下調程度均更加明顯(P<0.01),見Fig 8,9。

Fig 8 Expression of SUMO-1,HIF-1 α,VEGF and its receptor protein in spleen tissues of mice in each group

Fig 9 Target protein gray levels in spleen tissue of mice in each

4 討論

在古代中醫(yī)典籍中并無“腺樣體肥大”病名,但根據(jù)其臨床表現(xiàn)或常見并發(fā)癥可歸屬于“鼻窒”、“鼾眠”、“乳蛾”等疾病中。元代朱丹溪《丹溪心法·卷二·痰十三》[9]書中云:“凡人身結核不紅、不痛、不做膿,皆痰注也……痰挾瘀血,遂成囊窠”,故AH可歸屬于“痰核”、“囊窠”范疇,而喻嘉言《寓意草》中也描述:“窠囊之來,始于痰聚胃口,……痰入既久,則阻礙氣道,而氣之奔入者,復結一囊也”,說明本病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸與“痰”密切相關,治療上應以“化痰散結”為主。兒童AH屬肺系疾病,小兒肺臟尤嬌,感染外邪首先犯肺,肺主治節(jié)又為水之上源,肺氣失宣則津液不得正常輸布,凝而為痰,但肺為“貯痰之器”,脾才是“生痰之源”,加之肺脾為母子之臟,在生理、病理及經(jīng)絡循行上均密切相關,小兒又“脾常虛”,脾運失健,樞機不利,水濕停聚,聚而成痰,痰濁蘊結肺道,痰氣交阻,停聚于上氣道,終致腺樣體肥大[10],故在治療上重視“運脾化痰”。《景岳全書》有言:“善治痰者,惟能使之不生,方是補天之手”,加之脾胃本為后天之本,“四季脾旺則不受邪”,故從治脾入手治療兒童AH,一方面截斷生痰之源,一方面脾健則人體氣血旺盛,能護衛(wèi)機體、祛邪抗病。本課題組在前期的臨床試驗中也證實以“運脾”為理論基礎的“運脾化痰通絡方”治療兒童AH具有良好的臨床療效[4,11],同時對細胞免疫具有調節(jié)作用[4]。方中未將通竅、化痰或是散結藥物作為君藥,而是以蒼術燥濕運脾、薏苡仁健脾滲濕共為君藥,全方將化痰、通竅寓于健脾之中,使脾健則痰化,痰化則絡通,絡通則結散,結散則氣行。

對于“運脾法”治療兒童AH,本課題組前期側重于臨床研究,對其作用機制研究尚缺乏,網(wǎng)絡藥理學通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫,結合生物學、基因蛋白組學等理論,構建“藥物-成分-靶點-疾病”互作的網(wǎng)絡,可以整體預測復方的作用機制,是研究中藥復方藥理的重要方法。故課題組將“運脾治鼻”的代表方劑運脾化痰通竅方中作用“運脾”的君藥“蒼術-薏苡仁”進行網(wǎng)絡藥理學分析,結果顯示其主要活性成分為豆甾醇、谷甾醇、蒼術酮等。谷甾醇和豆甾醇都屬于植物甾醇,是多種植物類中藥的重要化學成分,有抗炎、抗氧化、抗菌等生物活性[12],有研究[13]發(fā)現(xiàn),谷甾醇可通過抑制炎癥小體NLRP3的激活,來抑制CAS1的產生及MAPK信號通路的活化,從而下調細胞中IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平而起到抗炎作用,且谷甾醇免疫調節(jié)功能較強,研究表明[14]其與維生素D3 聯(lián)用可增強巨噬細胞的免疫作用。豆甾醇則在實驗中被證實能減輕IgE介導的齲齒動物的皮膚過敏反應[15],說明其有一定抗過敏作用。蒼術酮是蒼術的特征成分,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蒼術酮通過激活SIRT3誘導巨噬細胞向M2型轉換,從而減輕細胞損傷[16],部分揭示了運脾化痰通竅方治療AH的分子作用機制。通過對有效成分及其生物活性作用的分析顯示,“蒼術-薏苡仁”藥對AH主要作用與抗炎、抗氧化,抗過敏等作用相關。

通過“藥物-疾病”靶點交集可得出核心靶點30 個,其中度值較高的有HIF-1、VEGFA、IL-6、TP53等,富集分析結果也顯示“運脾法”治療AH參與的通路主要與炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等相關,如多種細胞凋亡、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等。因此,我們對“運脾法”治療AH可能的部分通路作驗證性實驗,選擇特征性成分蒼術酮及富集分析結果提示的較為富集的與氧化應激密切相關的HIF-1信號通路,以期證實“健脾法”對AH缺氧狀況的改善作用。結果表明,蒼術酮能有效下調缺氧模型小鼠SUMO-1、HIF-1α、VEGF及VEGF-R的蛋白表達。AH患兒由于上呼吸道阻塞可導致機體間歇性缺氧,人體氧感受器通過一系列的信號轉導,激發(fā)低氧誘導適應性基因的高表達,才能維持組織氧供,并增強細胞在缺氧情況下的生存能力。缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是維持人體氧平衡的重要轉錄因子,有HIF-1α和 HIF-1β兩個亞基,其中 HIF-1α是調節(jié)亞基,在血管重塑、細胞增殖、葡萄糖和能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用[17],HIF信號通路通過激活大量缺氧適應性基因來保護細胞免受缺氧誘導的損傷,而HIF-1就是此類適應性基因表達的主要調控者。小泛素類蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)能共價修飾HIF-1蛋白,特別是SUMO-1在缺氧應激反應中有著重要的作用,在低氧環(huán)境下,反應性蛋白表達應激性增高,可促進SUMO-1的表達,以及HIF-1α的SUMO修飾,同時血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)啟動子被激活,與HIF-1α結合,增強VEGF基因的轉錄活性。有研究表明低氧微環(huán)境下HIF-1α通過SUMO化修飾增強其蛋白轉錄活性,導致相關下游基因表達升高,從而影響宿主細胞的分化及生物學功能[18]。另一方面,HIF-1α還廣泛參與機體的炎癥反應和免疫應答,如炎癥過程中,細胞分泌的炎性因子可調節(jié)HIF-1α的穩(wěn)定性,上調其下游因子VEGF等的表達,IL-1β、TNF-α、PGE2及LPS等致炎性細胞因子均能激活HIF-1α的轉錄活性,在炎癥細胞中聚集并影響細胞的生物學功能。總之,炎癥及缺氧改變可能通過HIF-1α-SUMOylation通路調節(jié)其蛋白轉錄活性,從而影響相關下游基因的表達及宿主細胞的生物學功能,結合本次網(wǎng)絡藥理學研究及動物實驗驗證結果,可以認為,“運脾”藥物能抑制 HIF-1α-SUMOylation逆轉缺氧及炎癥反應,干預AH的發(fā)病與發(fā)展。

兒童AH治療重點在于“運脾”、“化痰”、“通竅”,脾為后天之本,為人體氣血之源,脾健不在補而貴在運,“運”即運化之意,運脾即恢復脾胃生理功能,以運化水谷營養(yǎng)全身,運化水液使之不至于蓄集成痰,達到“化痰”目的,脾健則氣血生化有源,氣通血行,孔竅通利,絡脈流暢而“通竅”。另外,“痰”在中醫(yī)學中是致病因素也是病理產物,現(xiàn)代研究所理解的“痰”是各種異物、病原微生物,炎癥細胞及壞死脫落的粘膜上皮細胞所組成的,故“化痰”包括現(xiàn)代醫(yī)學的“抗炎”作用。我們應用“蒼術-薏苡仁”藥對治療兒童AH進行網(wǎng)絡藥理學研究,其主要成分、核心靶點、重要通路均與抗炎、免疫調節(jié)、抗氧化等相關,也通過動物實驗進行了驗證,說明通過“運脾”可以達到以上所述療效,也從分子層面一定程度上體現(xiàn)了其作用機制。