甲基化轉移酶樣蛋白3介導的m6A修飾參與高靜水壓誘導的心房肌細胞電重塑

劉攀月,曾 瓏,肖海茵,肖菲菲,朱 蕊,楊 慧,鄺素娟,鄧春玉,饒 芳,魏 薇

(1.華南理工大學醫學院,廣東 廣州 510006;2.廣東省心血管病研究所心內科,廣東省人民醫院,廣東省醫學科學院,廣東 廣州 510080)

作為最常見的快速性心律失常之一,心房顫動(房顫,atrial fibrillation,AF)患者心臟衰竭、中風和外周血栓栓塞的風險增加。高血壓(hypertension,HTN)是AF發生的獨立危險因素,流行病學研究顯示,HTN使新發AF的風險增加1.8倍,使永久性AF的發病風險增加1.5倍[1]。HTN患者由于高靜水壓、牽張力和神經激素等影響,左心房發生彌漫性電重塑,使AF易于發生。電重塑是指由心房肌細胞中Ca2+或者K+通道密度改變導致動作電位時程(action potential duration,APD)縮短,折返的發生和電特性的改變,其中L型鈣通道蛋白(L-type calcium channel α1C,Cav1.2)的減少及L型鈣電流(L-type calcium current,ICa,L)的減少是APD縮短的主要原因[2]。前期研究表明,高靜水壓下HL-1細胞發生ICa,L和超速延遲整流鉀電流(Ikur)改變,AF易感性增加[3-4],但高血壓致AF的具體分子機制尚不清楚。

轉錄后修飾可調控細胞新陳代謝、細胞增殖和細胞遷移等,與心血管疾病密切相關[5]。m6A修飾屬于轉錄后修飾的一種類型,由各種轉甲基化酶(METTL3、METTL14、RBM15、RBM15B、KIAA1429、WTAP等)和去甲基化酶(FTO和ALKBH5)動態調控。轉甲基化酶或去甲基化酶與靶RNA結合后,可通過添加/去除m6A修飾調節RNA的生理過程,如穩定性、定位、剪接、翻譯等生理過程[6]。研究表明,m6A修飾可間接參與心肌細胞電活動,冠狀動脈結扎誘導心梗小鼠模型METTL3明顯升高,m6A修飾小膠質細胞中Toll樣受體4 mRNA,從而增強交感神經活動誘導室性心律失常的發生[7];m6A修飾可直接參與心肌細胞電活動,敲除FTO的小鼠發生心臟電學重塑和結構重塑,心率變異性增加、心室復極化時程改變,表明m6A甲基化的增加可以使小鼠更容易發生快速性心律失常[8]。然而,依賴于METTL3的m6A修飾是否在HTN致AF的電生理機制中發揮表觀遺傳作用還有待確定。我們擬通過本研究探討METTL3介導的m6A修飾是否參與高靜水壓對ICa,L的調控,進而促進房顫的發生發展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器抗m6A抗體(Synaptic Systems,202003);抗METTL3抗體(Abcam,ab195352);抗Cav1.2抗體(Alomone,ACC003AN7108);抗GAPDH抗體(Proteintech,60004-1-I);兔二抗(Jackson ImmunoResearch,111-035-003);鼠二抗(Jackson ImmunoResearch,111-015-003);STM2457(MedChemExpress,2499663-01-1);亞甲藍(BioReagent,M4159-25G);反轉錄試劑盒(Accurate Biotechnology,AG11734);預混型qPCR試劑盒(Accurate Biotechnology,AG11733);熒光定量PCR儀(qTOWER3 G);RIP試劑盒(BersinBio,Bes5101);紫外交聯儀(ZIXING1793);正置熒光顯微鏡(Nikon,80i);EPC10膜片鉗放大器及附件(HEKA)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物 SPF級C57BL/6J雄性小鼠(35 g左右),使用Alzet微滲透泵持續皮下泵入血管緊張素4周(給藥劑量為1 000 ng·kg-1·min-1),構建HTN模型小鼠(n=6)。選取另外6只性別、體質量匹配的C57BL/6J小鼠作為對照,動物從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買,許可證號為SCXK(湘)2019-0004。小鼠模型造模成功后留取心房組織,分裝后放入液氮速凍再保存至-80 ℃冰箱。本研究已經通過廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)動物實驗倫理委員會審查(No 201904010451)。

1.2.2細胞培養與干預 本研究所使用的小鼠心房肌細胞系HL-1由美國路易斯安那州立大學William Claycomb教授慷慨贈送。Claycomb專用培養基、10%胎牛血清、0.1 mmol·L-1去甲腎上腺素和2 mmol·L-1左旋-谷氨酰胺培養細胞。待細胞密度長至約80%時,使用0.05%胰酶消化后將細胞種于3.5 mm×10 mm小皿中進行后續干預實驗。以常壓(0 mmHg)作為對照,設置了不同壓力梯度(20、40 mmHg)干預細胞48 h。為了觀察干預METTL3能否逆轉高靜水壓下Cav1.2的下調,分別利用 STM2457 和si-METTL3來干預METTL3的功能和合成,設置對照組、高壓+DMSO組、高壓+STM2457組、高壓+陰性對照si-ctrl組及高壓+si-METTL3組。STM2457 配制濃度1、3、10 μmol·L-1,陰性對照si-ctrl和si-METTL3(CAAGGAAGAGTGCATGAAA)配制成50 nmol·L-1分別轉染HL-1細胞。

1.2.3斑點印跡實驗 提取組織或細胞中RNA后檢測濃度,將一定量的RNA滴于N+尼龍膜上,自然風干尼龍膜后置于紫外交聯儀下照射10 min,5%脫脂牛奶進行室溫封閉2 h,1 ∶1 000稀釋的抗m6A抗體過夜孵育N+尼龍膜。隨后兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,PBST 5 min洗3次后置于化學發光成像儀下顯影。顯影后0.01%亞甲藍孵育N+尼龍膜10 min,在自然光下拍攝尼龍膜作為對照。

1.2.4mRNA定量檢測和蛋白定量檢測 qRT-PCR和Western blot詳細實驗步驟見既往發表的文獻[9],各引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers used for real RT-PCR

1.2.5全細胞膜片鉗實驗 細胞干預充足時間后使用預熱的0.05%胰酶消化3 min,顯微鏡下可見細胞輪廓變圓終止消化,30 min后進行全細胞膜片鉗實驗。使用進液針將電極內液注入玻璃電極后,要求入液時電極電阻達到2～5 MΩ。選取大小合適的細胞,電極尖端輕觸細胞表面可產生微小形變,給予些許負壓后可觀察電阻變大,待電阻達到1 GΩ(高阻封接)時使用電刺激破膜,補償快慢電容、串聯電阻。全細胞狀態穩定后,電壓鉗模式記錄ICa,L及膜電容(Cm),電流鉗模式記錄動作電位(AP),最后使用Clampfit 10.4測量數據及統計。HL-1 ICa,L電極內液成分:CsCL 100 mmol·L-1,TEA-CL 20 mmol·L-1,EGTA 10 mmol·L-1,HEPES 10 mmol·L-1,Tris將pH調至7.2;ICa,L細胞外液成分:TEA-CL 140 mmol·L-1,CaCl2·2H2O 5 mmol·L-1,MgCl2·6H2O 2 mmol·L-1,HEPES 10 mmol·L-1,Glucose·H2O 10 mmol·L-1,Tris將pH調至7.4;HL-1 AP電極內液成分:KCl 140 mmol·L-1,MgCl2·6H2O 1 mmol·L-1,HEPES 10 mmol·L-1,EGTA 5 mmol·L-1,KOH將pH調至7.2;AP細胞外液成分:NaCl 136 mmol·L-1,KCl 5.4 mmol·L-1,MgCl2·6H2O 1.0 mmol·L-1,NaH2PO4·2H2O 0.33 mmol·L-1,HEPES 238.3 mmol·L-1,D-Glucose 10 mmol·L-1,CaCl2·2H2O 1.8 mmol·L-1,NaOH將pH調至7.4。

1.2.6RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗 使用BersinBio RIP試劑盒(BersinBio,Bes5101)進行RIP實驗,根據試劑的說明書,使用裂解緩沖液收集細胞,并將裂解后的RNA-蛋白質復合物與轉載IgG或抗METTL3抗體(Abcam,ab195352,1 ∶100)的磁珠4 ℃過夜孵育,RIP洗滌緩沖液將磁珠-蛋白-RNA復合物于4 ℃搖床上洗滌10 min,然后用RIP裂解緩沖液于4 ℃搖床上洗滌5 min,收集洗脫下來的含有RNA的上清,并用TRIzol/氯仿/異丙醇提取RNA,利用qRT-PCR檢測RNA的表達量。

2 結果

2.1 HTN小鼠左心房組織RNA m6A表達增加及形態學改變斑點印跡實驗結果顯示與對照組野生型(WT)小鼠相比,HTN組小鼠左心房組織中m6A含量增加(定量為400 ng時,P<0.01;定量為200 ng時,P<0.05)(Fig 1A-B);相較于WT組小鼠,HE染色提示,HTN組小鼠左心房心肌細胞結構更為紊亂,同時間質含量增加,Masson染色提示HTN小鼠左心房組織膠原含量增加(Fig 1C)。m6A的含量是否與HTN小鼠發生心房重塑有關還需進一步探究。

2.2 HTN小鼠左心房組織METTL3,Cav1.2的表達減少RNA m6A水平主要是由轉甲基化酶和去甲基化酶介導,因此我們進一步檢測了WT和HTN組小鼠左心房組織中,轉甲基化酶METTL3、METTL14、RBM15、RBM15B、KIAA1429、WTAP和去甲基化酶FTO、ALKBH5的RNA表達量。結果發現,與WT組相比,HTN組小鼠心房組織中METTL3明顯增加(P<0.01),而FTO、KIAA1429則明顯下調(P<0.05)(Fig 1D)。我們進一步在蛋白水平驗證METTL3的表達改變,發現結果與mRNA水平一致(P<0.01),同時Cav1.2在HTN組中明顯減少(P<0.01)(Fig 1E-F)。Cav1.2的減少是否與METTL3介導的m6A修飾有關需進一步驗證。

2.3 高靜水壓對HL-1細胞RNA m6A、METTL3、Cav1.2的影響體外予以不同的靜水壓(20 mmHg和40 mmHg)模擬心房高壓的病理狀態,斑點印跡實驗顯示HL-1中m6A的含量隨著靜水壓的增加而增加(P<0.01 in 20 mmHg,P<0.01 in 40 mmHg)(Fig 2A,B),同時HL-1細胞中METTL3蛋白的含量隨著靜水壓的升高而增加(P<0.01 in 20 mmHg,P<0.01 in 40 mmHg),而Cav1.2蛋白表達則隨著靜水壓的升高而降低(P<0.05 in 20 mmHg,P<0.01 in 40 mmHg)(Fig 2C,D)。提示高靜水壓下心房肌細胞RNA m6A、METTL3增加,同時細胞中Cav1.2減少,與動物模型實驗結果一致。

2.4 METTL3抑制劑STM2457逆轉高靜水壓所致的HL-1細胞Cav1.2下調為了進一步明確METTL3在高靜水壓所致心房肌細胞的Cav1.2表達和ICa,L下降中的作用,HL-1細胞加壓之前,予METTL3的特異性抑制劑 STM2457(1、3、10 μmol·L-1)預處理細胞3 h。斑點印跡實驗結果表明,STM2457 對高靜水壓組的HL-1細胞具有m6A抑制作用(P<0.01 in 3,10 μmol·L-1),而相較于加壓組,STM2457使Cav1.2的表達量有所增加,并在10 μmol·L-1時差異有統計學意義(P<0.05 in 10 μmol·L-1)(Fig 3A-C)。

同時使用全細胞膜片鉗技術記錄常壓下、高靜水壓下、高靜水壓+STM2457(10 μmol·L-1)各組HL-1細胞ICa,L和動作電位(AP)。對比常壓下,使用40 mmHg高靜水壓處理HL-1細胞時,細胞APD50、APD70、APD90均明顯縮短,而使用STM2457處理高靜水壓下的HL-1細胞時,則APD50、APD70、APD90均有增加(P<0.05)(Fig 3D,F),但動作電位振幅(action potential amplitude,APA)差異無顯著性(Fig 3E)。ICa,L峰值電流密度在高靜水壓組明顯降低,并在10 μmol·L-1STM2457 的干預下逆轉(峰值電壓為+10 mV時,2.70±0.26 pA/pF in 0 mmHg+DMSO groupvs-1.61±0.28 pA/pF in 40 mmHg+DMSO groupvs2.25±0.45 pA/pF in 40 mmHg±STM2457 ,P<0.01)(Fig 3G-H)。各組ICa,L的激活、失活電壓-電流關系,復活時間曲線無明顯差異(P>0.05)(Fig 3I-J)。

Fig 1 Expression of m6A-modified mRNA,methylases,Cav1.2,METTL3 in left atrial

Fig 2 Effect of high hydrostatic pressure on m6A-modified mRNA,METTL3 and Cav1.2 in HL-1

2.5 敲低METTL3可逆轉高靜水壓所致的HL-1細胞Cav1.2下調敲低METTL3后觀察對高靜水壓所致心房肌細胞電重塑的逆轉作用。予METTL3 siRNAs轉染HL-1細胞后,加壓干預48 h(40 mmHg)。結果發現,成功敲低METTL3后,HL-1細胞的RNA m6A表達水平減少(P<0.01)(Fig 4A-B),說明METTL3發揮了轉甲基酶的作用。Western blot結果顯示,敲低METTL3,可使Cav1.2較對照組有增加(P<0.01)(Fig 4D-F)。為了驗證METTL3對Cav1.2的調控作用,我們使用RIP及qRT-PCR檢測HL-1中 METTL3是否與CACNA1C結合。結果顯示,相對于IgG陰性對照,使用METTL3免疫沉淀后結合的CACNA1C明顯增加(P<0.01)(Fig 4C),說明METTL3可以直接結合CACNA1C,從而調控其蛋白Cav1.2的表達,影響心房肌細胞電重塑。

Fig 3 Effect of STM2457 on m6A-modified mRNA,METTL3 and iron channel current

Fig 4 Effect of si-METTL3 in HL-1 cells after treated with hydrostatic

3 討論

研究表明:(1)與對照組相比,HTN小鼠心房間質纖維化增加,心肌細胞分布紊亂,離子通道蛋白Cav1.2表達減少,提示高壓下誘導心房肌細胞發生電重塑。同時小鼠心房內m6A表達量增加,METTL3蛋白表達升高。(2)隨著靜水壓的升高,心房肌細胞HL-1細胞Cav1.2蛋白表達減少,m6A和METTL3蛋白表達增加;抑制METTL3的功能與合成可明顯降低高靜水壓下HL-1細胞 m6A的表達以及改善HL-1細胞的電重構,同時證明了METTL3直接結合CACNA1C,從而發生轉甲基修飾引起心房肌細胞電重塑。

心房肌細胞電重塑是AF發生和維持的重要機制,特別是L型鈣通道蛋白表達的降低和ICa,L的減少造成APD縮短是AF電重塑的主要內容,既往研究表明,在AF患者中Cav1.2的表達明顯減少,縮短了AF及患者的APD,從而提高AF的誘發率和促進AF持續發生[10];快速起搏心房兔模型Cav1.2泛素化降解增加,縮短APD和減少ICa,L,促進心房電重構[11]。HTN可通過多種機制誘導心房肌細胞電重塑,包括改變離子通道表達、影響Ca2+的內流和外流以及影響細胞內Ca2+穩態等[12]。L型鈣通道在HTN誘導的心房肌細胞電重塑中發揮著重要作用,高靜水壓直接激活Piezo1,將機械力轉變為生物信號誘導心房肌細胞ICa,L的電生理重塑[13];高靜水壓培養下,心房肌細胞的腎素-血管緊張素系統被激活,由FAK-Src促進ICa,L減小,AF易感性增加[4],與之前的研究結果一致,我們的研究結果表明,在HTN小鼠模型中Cav1.2蛋白表達明顯減少,提示HTN小鼠心房肌細胞L型鈣通道發生改變。同時HL-1施予高靜水壓(40 mmHg),APD50、APD70、APD90均明顯縮短,提示高靜水壓下心房肌細胞發生電重塑。有趣的是,高靜水壓下HL-1細胞L型鈣通道的激活、失活動力學并未發生改變,說明ICa,L密度的降低主要由Cav1.2蛋白表達減少引起。

上述研究[4,14]都集中在轉錄水平調控高靜水壓下心房肌細胞電重塑,尚不清楚在此過程中L型鈣通道的表達和功能變化是否與轉錄后修飾有關。近年來,RNA的m6A甲基化修飾作為一種轉錄后修飾日益受到關注,在m6A轉甲基酶復合物中,METTL3是催化m6A甲基化的主要亞基,負責在RNA上安裝甲基,細胞失去動態平衡時,METTL3在細胞內觸發全局mRNA甲基化,通過調節不同的mRNA亞群來決定其功能和命運[14]。多項研究表明,血管緊張素II通過METTL3誘導心肌細胞纖維化、心肌肥厚[15];血管緊張素II以濃度依賴的方式降低HTN豚鼠心室肌細胞ICa,L峰值密度[16]。但是METTL3是否參與高壓下Cav1.2蛋白表達下降,目前尚無相關報道。因此,本研究將m6A與AF聯系起來,在高壓的作用下,無論是小鼠體內還是心房肌細胞HL-1細胞中,m6A和METTL3均有增加,Cav1.2蛋白表達量減少;在體外使用 STM2457 處理高靜水壓下的HL-1細胞后,逆轉了高靜水壓下ICa,L的降低和APD50、APD70、APD90的縮短。同時RIP實驗證明了METTL3與CACNA1C直接結合,表明METTL3直接參與了高靜水壓下CACNA1C的m6A修飾,進而引起L型鈣通道蛋白表達減少,參與心房肌細胞電重塑,使AF易于發生。潘振偉教授實驗團隊使用METTL3基因敲除小鼠來探索m6A修飾在心臟電重塑中的效應,敲除METTL3可通過減少小鼠中CACNA1C的 m6A 修飾來上調 Cav1.2的表達,延長APD,從而增加室性心律失常的易感性[17]。我們研究結果與潘振偉教授團隊不一致可能是因為采用了不同的小鼠模型(我們的是血管緊張素誘導的HTN模型小鼠,他們的是METTL3基因敲除雜合子小鼠)及不同的研究部位(我們研究心房,他們研究心室),但都證明了METTL3對CACNA1C具有m6A修飾作用,METTL3可直接參與心肌細胞電活動的調控。

STM2457 是METTL3-METTL14轉甲基酶復合物的有效抑制劑,其抑制作用為競爭性結合METTL3的甲基結合位點,卻并未破壞METTL3-METTL14復合物的蛋白結構。且 STM2457 對METTL3具有高度的選擇性,對其他RNA甲基轉移酶沒有抑制作用[18]。基于上述研究,我們使用了 STM2457 抑制高靜水壓下HL-1中METTL3的轉甲基作用,逆轉了ICa,L的下調,但并未在HTN模型小鼠中使用 STM2457,因此 STM2457 對HTN小鼠心房肌細胞的影響是否也像體外實驗一樣降低AF易感性仍需進一步探究。

然而,本研究具有以下局限性有待完善:(1)只研究了一種離子通道電流(ICa,L),而致AF易感性增加的還有其他離子通道電流,如Ikur,Ik1等;(2)未在體內探究干預METTL3對HTN小鼠的影響,同時STM2457 在體內是否會對其他細胞產生毒性效應需進一步探索。

綜上所述,本研究證實了METTL3是高靜水壓致AF的關鍵調節因子,METTL3通過m6A修飾CACNA1C參與高靜水壓誘導的ICa,L下降,引起心房肌細胞電重塑;抑制METTL3可逆轉高靜水壓所致的Cav1.2下調,緩解高靜水壓誘導心房肌細胞膜離子通道蛋白重塑,從而降低AF易感性。本研究為RNA表觀遺傳學參與高靜水壓致AF的發病機制提供了實驗證據,為HTN合并AF的治療提供了潛在的途徑。