心腦舒通膠囊及有效成分對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性的影響及機(jī)制研究

王 萌,曹玉爽,郭莉琛,杜鑫苑,柴麗娟,袁 慶,胡利民

(天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617)

缺血/再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)腦損傷情況下,可引起大量炎癥、白細(xì)胞黏附、活性氧化等級(jí)聯(lián)反應(yīng),破壞血腦屏障(BBB),從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[1-2]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是BBB的重要細(xì)胞成分,其細(xì)胞間緊密連接蛋白功能障礙會(huì)導(dǎo)致BBB完整性破壞,加重腦損傷[3-4]。心腦舒通膠囊(Xinnao shutong, XNST)是中藥蒺藜科屬植物蒺藜(TribulusterrestrisL. T)干燥地上全草提取制成的膠囊劑,臨床廣泛應(yīng)用于腦缺血的治療[5]。前期研究發(fā)現(xiàn),XNST及其3種單體成分(化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、原薯蕷皂苷)能促進(jìn)OGD/R損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)因子釋放[6],且能明顯降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放[7]。本研究進(jìn)一步通過(guò)考察其對(duì)OGD/R損傷后BMECs屏障完整性的保護(hù)作用及機(jī)制,為XNST治療缺血性卒中的臨床應(yīng)用及其二次開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)試劑bEnd.3 細(xì)胞株(ATCC,美國(guó));缺氧小室(STEMCELL,27310,加拿大);熒光素鈉(Sigma,美國(guó));anti-lamin-B1 (ab171123)、Claudin-5 (ab15106)、Occludin (ab31721)、ZO-1(ab96594)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;anti-p-JNK(#4668,Invitrogen公司);anti-JNK(#9252,Invitrogen公司);anti-p38(#9212)、anti-p-ERK1/2(#9101)、anti-ERK1/2(#9102)、 β-actin(#4967)、anti-p-IκBα(#2859)、anti-I kappa B kinase (IKK)(#2697)、anti-p-IKK (#2697)、anti-NF-κB/p65(#3032)均購(gòu)于美國(guó)CST公司,Hoechst 33258 (Thermo,美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermo,FORMA3111型,美國(guó)),倒置相差顯微鏡(Nikon,TE200,日本),多功能讀板機(jī)(TECAN,瑞士),低溫高速離心機(jī)(BECKMAN,64R型,美國(guó)),超微量核酸分析儀(Malcom,E-spect,日本),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,7500型,美國(guó)),電阻儀(MERS00002,Millipore,美國(guó)),半干轉(zhuǎn)儀(Bio-rad,美國(guó)),熒光顯微鏡(Leica Microsystems,GER)。

1.3 方法

1.3.1藥物配制 XNST(批號(hào):Z22021965,吉林敖東股份有限公司,中國(guó)):準(zhǔn)確稱(chēng)量XNST中的藥粉溶于無(wú)菌超純水,分別配制1、10 g·L-1濃度母液于100 ℃沸水中煮沸30 min后過(guò)0.22 μm一次性過(guò)濾器,用時(shí)以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液按1 ∶1 000稀釋。單體化合物:①化合物Ⅱ-14A(C61H100O13),②化合物Ⅱ-5A(terrestrinin A),③原薯蕷皂苷化合物(protodioscin):稱(chēng)取各單體粉末溶于DMSO中配制成10 mmol·L-1母液,用時(shí)以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液按1 ∶1 000稀釋,單體化合物結(jié)構(gòu)式如Fig 1所示。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清和100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素的DMEM中,在5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3細(xì)胞分組和處理 對(duì)照組(control):將培養(yǎng)液置換為高糖緩沖液,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h,4 h后置換為DMEM培養(yǎng)液,置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

模型組(OGD/R):將培養(yǎng)液置換為無(wú)糖緩沖液,于缺氧小室內(nèi)進(jìn)行缺氧缺糖處理,向小室內(nèi)持續(xù)充入94% N2+5% CO2+1% O2的混合氣體5 min后關(guān)閉缺氧小室,將小室放入 37 ℃孵箱中培養(yǎng)4 h后,換成DMEM培養(yǎng)液,置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

加藥組:課題組前期研究發(fā)現(xiàn),XNST在1、10 mg·L-1濃度能明顯降低OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞炎癥因子TNF-α的釋放[7],因此本研究繼續(xù)以1、10 mg·L-1濃度XNST深入考察其對(duì)OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞屏障功能的影響。具體操作為缺氧缺糖處理同模型組,4 h后加入含XNST(1、10 mg·L-1)或化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、原薯蕷皂苷(10 μmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)液,并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4藥物對(duì)OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞跨膜電阻值(TEER)的影響 bEnd.3細(xì)胞按1×107L-1接種于Transwell小孔上層,連續(xù)檢測(cè)其電阻值變化,待電阻值達(dá)到穩(wěn)定值之后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行造模及加藥處理,具體操作方法及實(shí)驗(yàn)分組如1.3.3所示。24 h后每孔分別從3個(gè)不同地方檢測(cè)電阻值,每組3孔,同時(shí)測(cè)量無(wú)細(xì)胞的空白Transwell培養(yǎng)液的電阻值作為基準(zhǔn)值。

1.3.5藥物對(duì)OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞熒光素鈉透過(guò)率的影響 待 TEER 電阻值穩(wěn)定后,用 1×PBS 溶液清洗 Transwell 內(nèi)外兩側(cè)各 2～3次,向內(nèi)側(cè)加入200 μL新鮮配制的含 Na-Flu(100 μg·L-1) DMEM 溶液,外側(cè)加入0.5 mL DMEM 溶液,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育1 h。1 h后取外側(cè)100 μL溶液于96孔黑板中,將培養(yǎng)板放入熒光酶標(biāo)儀中測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm的熒光強(qiáng)度。

1.3.6RT-PCR法檢測(cè)藥物對(duì)Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA影響 bEnd.3細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞分組及處理如1.3.3所述。24 h后用預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞3次,用TRIzol法提取RNA。并按照SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增,用ABI 7500 RT-PCR 儀獲得每個(gè)樣品反應(yīng)的CT值,將mRNA水平歸一化為GAPDH水平,并根據(jù)以下公式計(jì)算處理細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照樣本的閾值循環(huán)(CT)值的變化倍數(shù):變化倍數(shù)=2(-ΔΔCT)。所有樣本均重復(fù)分析3次。特異性引物對(duì)列于Tab 1。

Tab 1 Specific primer pairs

1.3.7藥物對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 bEnd.3細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞分組及處理同1.3.3所述。24 h后用預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞2次。每孔加入100 μL蛋白裂解液(含1%PMSF),于冰上震蕩裂解15 min,刮下細(xì)胞于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。小心吸取上清并用BCA法測(cè)定其蛋白濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE膠質(zhì)進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜,將所述膜在室溫下用5%脫脂乳孵育2 h并且在4 ℃下用以下一抗孵育過(guò)夜:JNK、p-JNK、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Claudin-5、 Occludin 、ZO-1、NF-κB/p65、I kappa B alpha (IκBα)、p-IκBα、I kappa B kinase (IKK)、p-IKK、β-actin、lamin-B1作為內(nèi)參,4 ℃滾軸孵育過(guò)夜后用TBST漂洗相應(yīng)PVDF膜5 min×4次。加入相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h用TBST漂洗5 min×4次。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯影,使用ImageJ軟件從光密度值定量分析條帶。

1.3.8免疫熒光檢測(cè)Claudin-5/NF-κB的表達(dá) 將bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板上,4%多聚甲醛固定15 min,0.1% Triton-X 100滲透10 min,3%牛血清白蛋白封閉細(xì)胞1 h,加入Claudin-5和NF-κB/p65一抗孵育。用PBS洗滌細(xì)胞3次,加入抗兔Alexa Fluor?488、抗兔Alexa Fluor?555于37 ℃孵育30 min。PBS輕洗3次,Hoechst 33258孵育5 min。PBS洗滌細(xì)胞3次后熒光顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞TEER值及Na-Flu透過(guò)的影響如Tab 2所示,與control比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細(xì)胞的電阻值(P<0.01),增加Na-Flu透過(guò)率(P<0.01);與OGD/R比較,XNST(1、10 mg·L-1)及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin均能明顯增加損傷bEnd.3細(xì)胞的電阻值(P<0.01),降低Na-Flu透過(guò)率(P<0.01)。

Tab 2 Effect of drugs on TEER and Na-Flu permeability in damaged bEnd.3

2.2 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞Claudin-5熒光表達(dá)的影響如Fig 2顯示,control組Claudin-5熒光表達(dá)較強(qiáng),且內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完整;與control組比較,OGD/R組Claudin-5的熒光強(qiáng)度明顯降低,細(xì)胞間緊密連接破壞(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin均能增強(qiáng)Claudin-5熒光表達(dá),改善細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)(P<0.05);與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5熒光表達(dá)(P<0.05)。

Fig 1 Structural formula of three monomer compounds

2.3 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA影響如Tab 3所示,與control組比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的mRNA表達(dá)(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST、化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的mRNA表達(dá)(P<0.01),XNST能明顯增加Occludin的mRNA表達(dá)(P<0.05),protodioscin能明顯增加ZO-1的mRNA表達(dá)(P<0.01);與XNST組比較,化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的mRNA表達(dá)(P<0.05),protodioscin能明顯增加ZO-1的mRNA表達(dá)(P<0.01)。

Tab 3 Effect of drugs on Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA in OGD/R-damaged bEnd.3

2.4 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞Claudin-5/Occludin/ZO-1 蛋白表達(dá)影響如Fig 3所示,與control組比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白的表達(dá)(P<0.05);與OGD/R組比較,XNST能明顯增加bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin的蛋白表達(dá)(P<0.05),化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A明顯增加bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)(P<0.05),protodioscin明顯增加bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、ZO-1的蛋白表達(dá)(P<0.01);與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的蛋白表達(dá)(P<0.01),Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加ZO-1的蛋白表達(dá)(P<0.01)。

Fig 3 Effect of drugs on expression of tight junction protein in bEnd.3 cells under OGD/R n=3)

2.5 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞MAPK蛋白磷酸化表達(dá)的影響如Fig 4所示,與control組比較,OGD/R組能明顯增加JNK、p38、ERK1/2磷酸化水平(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST明顯降低了p-JNK水平升高(P<0.05),但p-p38和p-ERK1/2沒(méi)有降低。與OGD/R比較,化合物Ⅱ-5A和protodioscin治療明顯降低p-JNK、p-p38和p-ERK1/2表達(dá)水平(P<0.05),化合物Ⅱ-14A對(duì)p-JNK、p-p38和p-ERK1/2水平?jīng)]有明顯影響。與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯抑制ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)(P<0.01)。

Fig 4 Effect of drugs on phosphorylation expression of MAPK protein in OGD/R injury bEnd.3 cells n=3)

2.6 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位的影響免疫熒光染色檢測(cè)NF-κB的主要亞基p65是否被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),判斷NF-κB是否被激活。免疫熒光結(jié)果如Fig 5所示,與control組比較,OGD/R組NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位明顯增加;與OGD/R組比較,XNST、Ⅱ-14A、Ⅱ-5A和protodioscin均能明顯抑制NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位;與XNST組比較,protodioscin能明顯抑制NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位(P<0.01)。

2.7 藥物對(duì)OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示,與Control組比較,OGD/R組細(xì)胞核中核NF-κB/p65水平明顯升高(P<0.01),bEnd.3細(xì)胞質(zhì)中IκBα和IKK的磷酸化水平明顯增加(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST、Ⅱ-14A、Ⅱ-5A和protodioscin的NF-κB / p65易位以及IκBα和IKK蛋白磷酸化明顯降低(P<0.01);與XNST組比較,protodioscin能明顯抑制IKK蛋白磷酸化(P<0.01)。

Fig 6 Effect of drugs on NF-κB protein expression in OGD/R injury bEnd.3 cells n=3)

3 討論

既往研究和臨床試驗(yàn)均證實(shí),XNST對(duì)腦缺血具有明顯作用,臨床應(yīng)用于治療偏癱、語(yǔ)言障礙、動(dòng)脈硬化等[8-9]。藥理學(xué)研究表明,XNST可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)血管生成促進(jìn)急性腦缺血時(shí)MCAO/R大鼠的功能恢復(fù)[10]。BMECs具有緊密連接結(jié)構(gòu),限制細(xì)胞外物質(zhì)運(yùn)輸?shù)侥X,對(duì)維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[11]。BBB通透性增加可加重腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)展[12]。緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1是腦內(nèi)皮細(xì)胞維持緊密連接所必需的,它們可以密封相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙,為循環(huán)分子形成選擇性通透屏障[13]。本研究結(jié)果表明,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平,改善細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),增加細(xì)胞間跨膜電阻及降低熒光素鈉透過(guò)性,從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性,其中單體化合物protodioscin對(duì)Claudin-5及ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)作用明顯。

BMECs屏障功能受許多復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路和分子的調(diào)節(jié)[14]。MAPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Ser/Thr蛋白激酶,即c-jun N末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶(ERK1/2)和p38蛋白[15]。NF-κB信號(hào)調(diào)節(jié)各種免疫和內(nèi)皮屏障破壞的基因的表達(dá),這些信號(hào)調(diào)節(jié)主要促炎細(xì)胞因子、黏附分子和緊密連接蛋白的上調(diào)[16]。本研究結(jié)果顯示,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin明顯抑制JNK、ERK1/2、p38的蛋白磷酸化,抑制MAPKs信號(hào)通路激活。且能明顯抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位,抑制IκBα和IKK的磷酸化水平,表明其能通過(guò)抑制NF-κB通路激活來(lái)抑制炎癥反應(yīng)和發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性作用,其中單體化合物protodioscin對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位作用明顯。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin可改善OGD/R損傷內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性,穩(wěn)定細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),其機(jī)制可能與抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路激活有關(guān),且單體化合物protodioscin對(duì)增加緊密連接蛋白表達(dá)及抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位作用更為明顯。本研究結(jié)果可為XNST治療腦缺血的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù),也為從植物藥中尋找具有促血腦屏障完整性腦保護(hù)作用的單體化合物提供參考。