城市與山村青少年腸道菌群及其代謝組學差異的研究

沈續航,蘇時雨,關 靜,沈繼龍,陳 熙

人體腸道內存在大約100萬億個微生物,包括細菌、真菌和寄生蟲等,遠超人體自身的細胞總和。其中細菌為主要組成部分,主要存在于結腸尤其是結腸末端。它們與人體構成一個精密協調、動態平衡的生態系統,在調節宿主的免疫反應、參與能量代謝、維持腸黏膜細胞形態和功能上發揮重要作用[1]。早在1980年改革開放初期,中國城鎮化水平只有19.4%,至2019年已超過60%[2]。隨著中國城鎮化水平的提升以及工業化的發展,城鎮青少年的飲食習慣和生活環境也發生了巨大變化。而腸道菌群的結構與飲食習慣、生活環境等密切相關。大量的研究[3]表明,不健康的生活習慣可通過腸道菌群的失調而影響機體的內穩態,增加慢性疾病的發病率。雖然近年來腸道菌群與健康/疾病的關系研究較多,然而有關在校青少年學生,尤其是中國城市和山村中學生菌群的特征、差異及其意義尚未見文獻報道。該研究旨在分析城市和山村中學生腸道菌群及代謝產物的差異,揭示人體在生命早期建立健康的內穩態將直接影響其成年后的健康狀態或患病風險,警示城市青少年應通過調整飲食結構、合理提高運動量來改善腸道菌群結構從而保持健康的身體、降低相關慢性疾病的發病風險。

1 材料與方法

1.1 病例資料合肥市蜀山區第五十中學東校八年級學生,隨機選取14例。學生均為合肥市區出生并入學,所有的學生均無本市以外居住史。另外,在宣城市績溪縣伏嶺中心學校選擇八年級學生18例,學生均在當地山村出生并入學,無城市居住史。納入標準:① 年齡13～14歲;② 既往無胃腸病史。排除標準:① 近3個月內服用過抗生素或益生菌;② 近1年內有非居住地旅居史。

1.2 樣品收集晨起8:00左右,用無菌勺挑取排出的新鮮糞便1.0 g,一次性無菌糞便采集塑料杯儲存,每份標本標記姓名、年齡、性別置于干冰中轉運至-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 腸道菌群16S rDNA基因測序使用 MagPure Soil DNA LQ Kit基因組DNA抽提試劑盒,提取研究個體的糞便樣品DNA。針對16S rDNA基因的V3-V4高可變區進行PCR擴增,上游引物為343F(5′- TACGGRAGGCAGCAG -3′)、下游引物為798R(5′- AGGGTATCTAATCCT-3′)。PCR擴增產物經AMPure XP beads純化后送上海歐易公司進行雙端測序。

1.4 LC/MS非靶向代謝產物檢測取出凍存的腸道內容物樣本約60 mg裝入管中,加入內標(L-2-氯苯丙氨酸)20 μl,加入650 μl甲醇-水(4 ∶1)用研磨機進行研磨;冰水浴超聲提取,-20 ℃靜置;離心(13 000 r/min,4 ℃),裝入200 μl上清液于LC-MS進樣小瓶中揮干;用300 μl甲醇-水(1 ∶4)復溶;-20 ℃下靜置;離心(13 000 r/min,4 ℃),取150 μl的上清液-80 ℃下保存,以待后續LC- MS分析。將所有樣本的提取液等體積混合用作質控樣本。所有提取試劑使用前均在-20 ℃進行預冷。ACQUITY UPLC I-Class plus超高效液相串聯QE高分辨質譜儀組成的液質聯用系統作為分析儀器。色譜條件,色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3 (100.0 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:45 ℃;流速:0.35 mL/min;進樣量:2 μl;流動相: A-水(含0.1%甲酸),B-乙腈(含0.1%甲酸)。

1.5 16S rDNA測序分析原始數據為FASTQ格式,對樣品進行去雜和去除序列中的嵌合體序列,Vsearch軟件將相似度≥97%的序列歸為一個操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),物種比對注釋由RDP classifier軟件操作完成。之后,采用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)對兩組的樣本結果進行組與組之間相似性分析。用R軟件分析腸道菌群α多樣性、β多樣性及兩地中學生的腸道優勢菌屬。

1.6 統計學處理使用R語言和SPSS軟件進行統計學分析,正態定量資料采用t檢驗或者ANOVA檢驗,非正態定量資料采用非參數秩和檢驗。組間腸道菌群α多樣性差異分析、菌群豐度差異分析使用Wilcoxon秩和檢驗(非配對)。組間腸道菌群β多樣性分析采用基于Bray-curtis距離矩陣的主成分分析(principal component analysis,PCA)。代謝組學的分析中,使用PLS-DA和Wilcoxon秩和檢驗對不同組別的代謝物進行分析,變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值大于1、P<0.05的代謝物鑒定為組間差異代謝物。用Pearson相關系數衡量兩個代謝物之間的線性相關程度。代謝通路的變化通過鑒定出的組間差異代謝物比對到京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)查詢,通路富集分析P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OTU水平的venn分析使用Vsearch軟件,對質控得到的優質序列valid tags按照97%的相似度進行OTU分類,繪制venn圖。兩組32個樣本共產生5 780個OTU;其中2組共有的OTU為3 915個,城市與山村青少年特有的OTU分別為783個和1 082個。見圖1。

圖1 不同分組糞便樣本在OTU水平上的venn分組

2.2 Alpha多樣性、Beta多樣性分析通過Wilcoxont檢驗、PCA對山村青少年腸道菌群多樣性進行分析,兩組間差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 不同組別多樣性指標分析比較

圖2 兩組中學生糞便菌群多樣性對比

2.3 菌群差異分析城鄉青少年腸道菌群在屬水平上的結構有較大差異(圖3)。經Wilcoxont檢驗分析,差異較大的菌屬包括Lachnoclostridium(t=2.479,P<0.05)、糞厭氧棒狀桿菌(Anaerostipes)(t=3.028,P<0.05)、瘤胃球菌(RuminococcaceaeUCG-002)(t=-2.435,P<0.05)、巴恩斯菌(Barnesiella)(t=-2.109,P<0.05)和真桿菌(Eubacterium)(t=3.028,P<0.05)等。

圖3 兩組之間屬水平上的腸道菌群差異

2.4 多元分析代謝組差異為了探究城鄉中學生糞便代謝物之間的差異,對兩組用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),結果顯示兩組間糞便代謝物差異明顯(圖4A)。R2X(cum):0.494;R2Y(cum):0.894;Q2(cum):0.214。利用火山圖可以對P值,可視化VIP和Fold Change值,篩選差異代謝產物(圖4B)。與城市青少年組對比紅色、藍色點代表山村青少年組中顯著上調、下調的差異代謝產物;灰色點代表差異無統計學意義。相關性分析使用Pearson相關系數衡量2個代謝物之間的線性相關程度,紅色表示正相關,藍色表示負相關(圖4C)。通過KEGG(https://www.kegg.jp)數據庫檢索差異代謝物的相關代謝通路,基于KEGG數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析,山村中學生明顯高于城市中學生的代謝通路包括花生四烯酸代謝、血小板活化、5-羥色胺代謝、維生素的消化吸收、初級膽汁酸代謝(P<0.05)(圖4D)。

圖4 城鄉青少年腸道代謝產物以及其相關代謝通路差異

3 討論

城鄉兒童因飲食生活習慣、成長環境上的差異導致擁有不同的腸道菌群結構。有報道[4]顯示,城市青少年與農村青少年相比平均每人日膳食能量、脂肪和蛋白質的攝入量與功能占比均較高,而碳水化合物攝入量及供能以及膳食纖維占比則較低。碳水化合物、脂肪和蛋白質三大營養素攝入失衡與糖尿病、血脂異常、心腦血管疾病、腫瘤等慢性病的發生以及其并發癥密切相關。膳食脂肪的供能比過高會導致超重肥胖等相關慢性病的發病風險加大[5]。有研究[4]表明腸道菌群的構成結構在3歲以后已經與成人高度相似且相對穩定。該研究從腸道菌群結構以及代謝產物兩方面的差異來進行分析,期望能夠更加全面清晰的反映生活飲食習慣、生活環境不同的兩組青少年人群腸道微生態的差異以及其導致的終末代謝產物的差異,對未來改善青少年腸道菌群結構,在預防因腸道內穩態失衡而導致的慢性疾病中提供指導作用。

對兩組青少年糞便樣本進行測序分析后顯示,城市青少年腸道菌群在屬水平上Lachnoclostridium和Anaerostipes等占優勢。有研究[6]表明,Anaerostipes和Lachnoclostridium菌屬的某些菌種在抑郁癥患者的腸道菌群中占比增高,并且與色氨酸和5-羥色胺的代謝有關,可能預示著城市青少年有更大的精神壓力,比山村青少年有更高的抑郁癥發病風險。同時Lachnoclostridium菌屬在動脈粥樣硬化患者中顯著增加,它能夠將膽堿有效地轉化為微生物三甲胺(microbial trimethylamine,TMA),TMA裂解酶通過裂解TMA產生氧化三甲胺促進動脈粥樣硬化的發展[7]。更為重要的是Liang et al[8]近期調查研究了1 012例包括健康人群、結直腸腺瘤、結直腸癌患者糞便標本,結果顯示,Lachnoclostridium菌屬可作為非侵入性的結直腸腺瘤以及結直腸癌的診斷標志物。該研究表明該菌屬在城市青少年人群中占比明顯增高。有研究[9]表明腸道菌群中的特定菌屬可作為結直腸腫瘤發生發展的促進因素,且與疾病預后相關。該現象與城市人群結直腸癌發病率高于農村相符合,且近年來結直腸癌病人逐漸年輕化[10],警示城市青少年應養成良好的生活飲食習慣,注意預防篩查結直腸病變。

與城市學生不同的是,山村青少年腸道菌群在屬水平上以瘤胃球菌(RuminococcaceaeUCG-002)、巴恩斯菌(Barnesiella)、真桿菌(Eubacterium)等菌屬為優勢菌。Ruminococcaceae作為益生菌參與次級膽汁酸的產生,缺乏該菌可能會導致患腸道炎癥的概率增加,影響宿主的免疫系統[11]。Eubacterium菌屬與鞘氨醇水平呈正相關。鞘氨醇的在維持宿主脂質穩態中起重要作用。Eubacterium產生丁酸,丁酸是短鏈脂肪酸的重要成員。丁酸的缺乏會導致結腸炎的發生與病理加重[12]。同時有研究[13]表明,Eubacterium豐度下降也與自閉癥、阿爾茨海默病等精神疾病密切相關。

該研究代謝組學結果顯示,與城市中學生相比,山村中學生在花生四烯酸代謝、血小板活化、5-羥色胺代謝、維生素的消化吸收、初級膽汁酸代謝等通路的表達顯著上調。其中花生四烯酸代謝可以通過激活Wnt信號通路,刺激腸道上皮細胞的更新再生,在維持腸道上皮完整性以及預防結腸炎中發揮重要作用[14];5-羥色胺代謝可調節認知與記憶能力[15];已知初級膽汁酸代謝參與了免疫調節并維持免疫穩態[16]。

該研究雖然樣本量不大,但是屬于兩組正常人群的對比觀察,而非是作為疾病的對照。后續的研究正在進行中,包括加大樣本量和完善相關信息,為揭示城鄉青少年腸道菌群與代謝產物差異以及維護在校青少年健康提供可靠的依據。