抑制陰道加德納菌的乳桿菌的篩選及其抑菌機(jī)制的研究

張 瑞,馬愛昕,王君竹,李 昶,尹海旭,白會(huì)會(huì),劉朝暉

細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis, BV)是最常見的女性下生殖道感染之一[1],主要表現(xiàn)為陰道微環(huán)境中的乳桿菌大幅減少、以陰道加德納菌為代表的厭氧菌大量增殖[2]。研究[3]表明:BV與盆腔炎、不孕、不育、流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒感染和宮頸HPV感染等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。關(guān)于BV的發(fā)病機(jī)制研究持續(xù)了很多年,但究竟是乳桿菌減少導(dǎo)致厭氧菌增殖,還是厭氧菌的增殖導(dǎo)致乳桿菌的減少,一直沒有明確的結(jié)論。有些研究認(rèn)為是乳桿菌減少,厭氧菌伺機(jī)獲得增殖機(jī)會(huì),占據(jù)主導(dǎo)地位;研究[4-5]表明不同的陰道微環(huán)境類型,會(huì)導(dǎo)致陰道上皮細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)物的種類和數(shù)量有所不同,產(chǎn)生和釋放的生物活性物質(zhì)的種類和數(shù)量不同,對(duì)微環(huán)境的保護(hù)能力存在差別。目前尚不清楚健康女性乳桿菌的各個(gè)菌種是否均對(duì)陰道加德納菌增殖有抑制作用。以往研究對(duì)篩選具有抑制陰道加德納菌的乳桿菌的研究較少。該研究將從人體分離乳桿菌菌株、陰道加德納菌菌株,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討中國(guó)健康女性陰道乳桿菌菌株對(duì)陰道加德納菌的增殖的抑制效果,并對(duì)可能的機(jī)制做初步探討。

1 材料與方法

1.1 病例資料BV人群:2021年11月—2022年6月在北京大學(xué)第一醫(yī)院門診就診的18～45(28.0±2.1)歲、陰道微生態(tài)Nugent評(píng)分大于6分的育齡期女性。排除標(biāo)準(zhǔn):① 處于月經(jīng)期;② 1個(gè)月內(nèi)使用抗生素或者抗真菌藥物者;③ 1個(gè)月內(nèi)口服或者外用避孕藥者;④ 48 h內(nèi)曾經(jīng)陰道用藥或者陰道沖洗者;⑤ 半年內(nèi)曾經(jīng)被診斷過(guò)陰道其他感染性疾病,如外陰陰道假絲酵母菌病、滴蟲性陰道炎。

健康女性人群:同期在北京大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心體檢的無(wú)自覺癥狀和疾病的健康女性。排除標(biāo)準(zhǔn):① 近1周內(nèi)陰道用藥者;② 1月內(nèi)用過(guò)抗生素或抗真菌藥者;③ 2周內(nèi)有任何不適;④ 半年內(nèi)被診斷過(guò)下列任何一種疾病者:盆腔炎,宮頸炎,陰道炎,其他婦科炎性疾病(支原體、衣原體、淋病、梅毒等);⑤ 性伴侶近期被診斷過(guò)患性傳播疾病者(支原體、衣原體、淋病、梅毒);⑥ 婦科檢查發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性體征者。

該研究獲得北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2017研92),所有志愿者均自愿簽署知情同意書。

1.2 菌株分離、純化和鑒定

1.2.1陰道乳桿菌的分離和純化 ① 無(wú)菌棉拭子取健康女性陰道側(cè)壁中1/3分泌物,涂MRS瓊脂平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑菌落,涂片,革蘭染色,鏡檢確認(rèn)為革蘭陽(yáng)性大桿菌后,再以MRS液體培養(yǎng)基增菌后凍存;② 凍存的革蘭陽(yáng)性大桿菌復(fù)蘇后涂MRS培養(yǎng)板,37 ℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.2陰道加德納菌的分離和純化 ① 無(wú)菌棉拭子取BV患者陰道側(cè)壁中1/3分泌物,涂于改良BHI瓊脂板上。② 將涂有陰道分泌物標(biāo)本的改良BHI瓊脂板裝進(jìn)厭氧袋,放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。③ 挑取圓形、針尖樣、半透明單菌落,涂在新的改良BHI瓊脂培養(yǎng)板上,37 ℃、厭氧培養(yǎng)24～48 h。④ 從培養(yǎng)板上挑取單菌落,將獲得的菌落凍存。

1.2.3菌株鑒定 通過(guò)菌落PCR,使用引物27F/1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGYTACCTTGTTACGACT-3′)擴(kuò)增臨床分離菌株的16s rRNA基因全長(zhǎng),PCR產(chǎn)物送測(cè)序由上海生工生物技術(shù)公司完成,將拼接結(jié)果的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上的細(xì)菌16s rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì),完成菌株鑒定。

1.3 Spot on lawn法篩選具有抑菌功能的乳桿菌將乳桿菌菌液濃度調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)(McFarland,MCF),100 μl點(diǎn)種在MRS瓊脂平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,再將含陰道加德納菌菌株的軟瓊脂培養(yǎng)基覆蓋其上,厭氧培養(yǎng)48 h,觀察有無(wú)抑菌環(huán)形成。

1.4 雙層牛津杯法檢測(cè)菌體、菌液和上清液對(duì)加德納菌的作用選出在spot on lawn實(shí)驗(yàn)中對(duì)陰道加德納菌增殖有抑制作用的乳桿菌菌株,進(jìn)行雙層牛津杯法實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)皿底層的MRS瓊脂平板上放置牛津杯,上層為含有陰道加德納菌菌株的軟瓊脂。取培養(yǎng)18 h的乳桿菌菌液200 μl共4份,2份離心獲得上清液,1份無(wú)菌PBS清洗3遍獲得菌體,另1份為菌體菌液混合物。

每個(gè)乳桿菌菌株做4個(gè)孔,分別加入:上清液、菌體、菌液以及上清液+蛋白酶K。用MRS液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,分別測(cè)量各自的抑菌環(huán)直徑。所有菌株的檢測(cè)分別做3次。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本收集情況共納入志愿者30例,其中健康女性20例,BV患者10例,各組臨床資料如表1所示,基線資料在健康組與BV兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 基線資料

通過(guò)體外培養(yǎng)、分離、純化和鑒定,健康組每份標(biāo)本中均能分離出乳桿菌,從20例標(biāo)本中共獲得乳桿菌菌株62株,分別屬于6個(gè)菌種(表2)。BV組10份標(biāo)本中,2份標(biāo)本中分離出3個(gè)陰道加德納菌菌株,另外8份未分離出陰道加德納菌。

表2 分離的乳桿菌及其抑菌情況

2.2 乳桿菌抑菌試驗(yàn)在62株乳桿菌菌株中有18株對(duì)陰道加德納菌的增殖有抑制作用,44株對(duì)陰道加德納菌菌完全沒有抑制作用(表2),在卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌中,有抑菌功能的菌株所占比例較高。

2.3 菌液、菌體、上清液和蛋白酶K處理組抑菌效果的區(qū)別如表3所示,篩選出的18個(gè)乳桿菌菌株中,所有菌株的菌液、菌體和上清液均有抑菌效應(yīng)。菌液的抑菌效應(yīng)明顯大于上清液組,其中14株差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上清液經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理之后,8份標(biāo)本的抑菌效果消失,10份標(biāo)本的抑菌效果不同程度減弱。

表3 菌液、菌體、上清液對(duì)陰道加德納菌的抑制情況

3 討論

健康女性陰道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),定植多種細(xì)菌,其中乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥、產(chǎn)生乳酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng),維護(hù)陰道微生態(tài)平衡[6-7]。某些因素作用下,如雌激素水平的降低,性行為及抗生素的使用等使陰道內(nèi)一些條件致病菌如陰道加德納菌過(guò)度生長(zhǎng),引起菌群失衡,導(dǎo)致BV的發(fā)生[8]。以往認(rèn)為BV的致病菌是陰道加德納菌,但是越來(lái)越多的研究[1-2]表明,除了陰道加德納菌之外,普雷沃菌、阿托波菌等多個(gè)厭氧菌可能也是BV的致病菌,但陰道加德納菌比其他致病菌具有更高的毒力潛能,具有更強(qiáng)的黏附能力和細(xì)胞毒性,更容易形成生物膜[9],在BV的發(fā)病機(jī)制中起著更加關(guān)鍵的作用[10-11]。因此,健康女性陰道乳桿菌對(duì)陰道加德納菌的抑制情況及其機(jī)制,對(duì)闡明BV的發(fā)病機(jī)制以及如何診治BV有重要作用。然而,既往關(guān)于乳桿菌抑制陰道加德納菌的研究很少,其中僅有王友芳 等[12]研究中分離的德氏乳桿菌已研制成新型的益生菌制劑。

在該研究中,健康組分離出的乳桿菌包含6個(gè)菌種,其中95%以上的標(biāo)本中含有兩個(gè)以上菌種,這與之前的研究[13]結(jié)果一致。每份標(biāo)本中均能分離出乳桿菌,從20例標(biāo)本中共獲得乳桿菌菌株62株。BV組的10份標(biāo)本中,2份標(biāo)本中分離出3個(gè)陰道加德納菌菌株,另外8份未分離出陰道加德納菌。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)陰道乳桿菌菌株的抑菌能力分析顯示,29.03%(18/62)的乳桿菌菌株具有抑制加德納菌增殖的功能,并不是所有的乳桿菌菌株都具有抑制病原菌的能力[3],這提示不同人群對(duì)BV的易感性可能存在差異[4]。發(fā)酵乳桿菌的分離率很低,但是分離出的菌株中有抑菌功能的菌株比例很高。加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌的分離率很高,但是有抑菌功能的菌株比例相對(duì)很低。

陰道乳桿菌對(duì)病原菌的抑制和清理機(jī)制分為間接途徑和直接途徑,間接途徑主要是影響人體陰道免疫功能,而直接途徑包括產(chǎn)生過(guò)氧化氫、乳酸、細(xì)菌素、細(xì)菌素樣物質(zhì)和表面活性物質(zhì)[14-16]。在該研究中表明,大部分乳桿菌體外培養(yǎng)的菌液有明顯的抑菌效果,上清液的抑菌效果明顯弱于菌液,這說(shuō)明乳桿菌抑制加德納菌的機(jī)制是多途徑[14-16],各種途徑在不同的菌株的抑菌過(guò)程中發(fā)揮作用的比重可能不同。然而菌體的抑菌作用和菌液大致相同這一現(xiàn)象不好解釋,可能是由于經(jīng)過(guò)PBS清洗之后的菌體加入MRS培養(yǎng)基之后,再加入牛津杯,經(jīng)過(guò)48 h的培養(yǎng)時(shí)間,相當(dāng)于新形成的菌液作用于底層的加德納菌平板。

經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理過(guò)的上清液的抑菌作用出現(xiàn)兩種變化:消失和減弱。這一現(xiàn)象說(shuō)明乳桿菌培養(yǎng)上清液中含有的物質(zhì)種類可能并不單一,不同的陰道乳桿菌菌株培養(yǎng)上清液抑制陰道加德納菌的機(jī)制也存在不同,抑菌作用消失的一類,可能主要通過(guò)蛋白類物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用,而抑菌作用減弱的一類,可能存在除了蛋白類物質(zhì)之外的機(jī)制發(fā)揮抑菌作用,比如乳酸或過(guò)氧化氫。