腺相關病毒介導的shRNA敲低大鼠雙側臂旁外側核EP3受體對發熱反應的影響

何田慧,王楠萍,吳思濠,魏滟麟,胥建輝,張 潔

外周注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)能夠誘導體溫調節中樞視前區合成釋放發熱介質前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2),PGE2與誘導發熱的關鍵受體即EP3受體結合后,引起炎癥性發熱[1-4]。研究[5-7]表明,參與前饋體溫調節的臂旁外側核(lateral parabrachial nucleus, LPB)也介導了發熱反應。在清醒和麻醉大鼠LPB局部應用PGE2均能引起明顯的發熱反應,其效應器機制與棕色脂肪代謝產熱和骨骼肌戰栗產熱增強,尾部皮膚散熱減少有關[6-7]。在LPS致熱過程中,LPB局部能夠合成PGE2,而且不管是減少LPB的PGE2生成,還是直接毀損LPB,均減弱了LPS性發熱反應,提示LPB部分參與了LPS致熱反應,但LPB的PGE2是否通過EP3受體參與LPS性發熱尚不清楚。該實驗采用RNA干擾、腦立體定位、無線遙測、能量代謝測定和實時熒光定量PCR等方法觀察敲低LPB的EP3受體表達對LPB微量注射PGE2和腹腔注射LPS引起的發熱反應的影響,以研究EP3受體是否介導LPB PGE2參與LPS致熱反應的過程。

1 材料與方法

1.1 材料雄性SD大鼠20只,體質量140～160 g,購自成都達碩實驗動物有限公司,在標準飼養條件下單籠飼養。腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)介導 的 AAV2-CMV-EGFP病毒(3.15×1012v.g./ml)及AAV2-shRNA-Ptger3(EP3)-EGFP病毒(3.42×1012v.g./ml)由上海吉凱基因化學技術有限公司提供, RNA Later購自美國Life公司,TRIzol購自美國Ivitrogen公司,PrimeScriptTMRT reagent Kit購自大連TaKaRa公司,FastStart Essential DNA Probes Master及實時熒光PCR探針購自美國Roche公司。腦立體定位儀(68018)購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司,動物能量代謝分析系統(CLAMS-HC-8R)及溫度傳感器(G2 E-Mitter transponders)均購自美國Columbus Instruments公司,冰凍切片機(CM1950)購自德國Leica公司,自動熒光顯微鏡(BX63)購自日本奧林巴斯公司,實時熒光定量PCR儀(CFX96)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 動物分組20只SPF級雄性SD大鼠隨機分為shRNA-control組(對照組)和shRNA-EP3組(實驗組)各 10只,每組動物中,5只用于實時熒光定量PCR實驗,5只用于體溫(Tcore)和能量代謝(EE)測定以及轉染情況觀察。分別向shRNA-control組和shRNA-EP3組大鼠LPB內注射AAV2-CMV-EGFP和AAV2- shRNA-Ptger3-EGFP病毒,2周后植入溫度傳感器,3周后植入留置導管,4周后進行相關指標檢測,實驗結束后處死大鼠制備含有LPB冰凍腦切片觀察轉染情況。

1.3 AAV2-shRNA-Ptger3-EGFP病毒合成shRNA干擾序列的篩選和病毒載體的構建由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。根據Ptger3(EP3受體)基因設計并合成3條shRNA干擾序列(表1)。經過外源篩選有效RNAi載體實驗檢測得知shRNA b序列對目的基因的表達有敲減作用,因而該靶點為有效靶點。最終通過AAV將shRNA b序列包裝為AAV2- shRNA-Ptger3-EGFP病毒。

表1 大鼠Ptger3的3條shRNA及陰性對照shRNA

1.4 腦立體定位和病毒干擾140～160 g的大鼠經4%戊巴比妥鈉 (1 ml/kg,腹腔注射)麻醉后,進行腦立體定位。LPB坐標為前囟后8.30～8.35 mm,中線左右旁開2.10 mm,深6.35～6.45 mm。每只大鼠LPB的2個位點分別注射250 nl病毒,注射速率為50 nl/min。3周后,于LPB上方植入留置導管。術后連續 3 d 肌肉注射頭孢曲松鈉(10 mg/100 g)以防止術后感染。

1.5 溫度傳感器植入和遙控測溫大鼠麻醉后,參照文獻[6-7]的方法,腹腔植入溫度傳感器。實驗前連續7 d,每天上午10時對實驗大鼠進行頭頸部撫摸(handle),以減輕大鼠的應激反應。實驗前1天下午,將大鼠移入清潔代謝籠,置于人工氣候箱內的無線遙測接收板上進行適應性過夜,并開啟動物代謝分析系統監測大鼠Tcore和EE。每日上午9:30—10:30利用大鼠頭部留置導管向大鼠LPB注射生理鹽水(0.1 μl)、PGE2(0.1 μg/0.1 μl)或腹腔注射脂多糖(100 μg/kg),隨后連續同步監測記錄10 h大鼠自由活動時的Tcore和EE。

1.6 AAV病毒轉染位點形態學檢測大鼠麻醉后,經升主動脈灌注生理鹽水和多聚甲醛溶液進行前固定,剝離鼠腦后進行后固定。用30%蔗糖溶液脫水,在冰凍切片機中沿冠狀面切片,制備30 μm厚含有LPB的腦切片,貼于黏附性玻片上,用抗熒光衰減封片劑封片后,用熒光顯微鏡檢測病毒注射的位點及轉染情況。

1.7 LPB EP3受體mRNA表達水平檢測大鼠麻醉后,斷頭取腦,參照文獻[6]用顯微鑷在冰上快速分離出LPB腦組織并轉移至RNA later中,儲存于-20 ℃備用。根據TRIzol試劑說明書提取樣品總RNA,并測定總RNA的濃度和純度。引物由成都擎科梓熙科技有限公司合成(表2)。根據PrimeScript 逆轉錄試劑盒說明書,將樣品總RNA反轉錄為cDNA。根據FastStart Essential DNA Probes Master試劑盒說明書檢測β-肌動蛋白(β-actin)和Ptger3(EP3受體)的mRNA水平。EP3受體mRNA通過β-actin(內參)mRNA 表達水平進行相對定量,計算方法為2-ΔΔCt。

表2 實時熒光定量PCR 引物

2 結果

2.1 AAV成功轉染大鼠LPB并敲低LPB EP3受體mRNA的表達由于對照病毒和干擾病毒均攜帶增強綠色熒光蛋白EGFP,故利用綠色熒光來觀察病毒表達部位。在熒光顯微鏡下觀察到shRNA-EP3組及shRNA-control組大鼠AAV病毒轉染均主要集中于LPB腦區(圖1A、B),提示AAV病毒成功轉染至兩組大鼠的LPB。接下來,通過實時熒光定量PCR驗證2組大鼠LPB的EP3受體mRNA表達的變化。結果顯示,與 shRNA-control 對照組相比,AAV病毒注射敲低了shRNA-EP3組大鼠LPB的EP3受體mRNA 的表達(P<0.05)(圖 1C)。提示,AAV 介導的 shRNA有效敲低了大鼠LPB EP3受體mRNA的表達。

圖1 病毒注射4周后大鼠 LPB轉染效果以及LPB EP3受體mRNA表達的變化

圖2 LPB應用生理鹽水對shRNA-control組和shRNA-EP3組大鼠Tcore和EE的影響

2.2 敲低LPB的EP3受體表達對基礎體溫的影響shRNA-control組和shRNA-EP3組大鼠在24 ℃環境中的基礎體溫差異無統計學意義;向2組清醒大鼠LPB微量注射生理鹽水均引起Tcore和EE出現短暫輕微的升高,但2組間差異無統計學意義(圖 2)。

2.3 敲低LPB的EP3受體表達對LPB PGE2致熱作用的影響向shRNA-control組清醒大鼠LPB注射PGE2引起Tcore和EE均明顯升高,其峰值分別出現在給藥后的30 min和25 min。而往shRNA-EP3組大鼠LPB注射PGE2引起清醒大鼠Tcore和EE均僅有輕微升高,與shRNA-control組相比,Tcore升高作用明顯減弱,EE也有降低趨勢(圖3)。

2.4 敲低LPB的EP3受體表達對LPS性發熱的影響shRNA-control組大鼠腹腔注射LPS引起典型的雙相發熱,體溫分別在2.5 h和5.5 h左右達峰值,且均高于基礎體溫水平。shRNA-EP3組大鼠腹腔注射LPS后也引起體溫升高,5.5 h體溫與基礎體溫比較明顯升高,但與shRNA-control組相比,發熱反應減弱,腹腔注射LPS后5.5 h的體溫明顯低于shRNA-control組,2.5 h的體溫也有降低趨勢(圖4)。

3 討論

在LPS等致熱源的刺激下,發熱介質PGE2合成并釋放到參與體溫調節的腦區,與其受體結合后引起發熱[1-4]。PGE2受體包括EP1-EP4 4個類型,其中EP3受體介導了PGE2的大部分中樞發熱效應,是誘導發熱的關鍵受體[2]。研究[6-7]表明,LPB也參與發熱反應,是PGE2在視前區外的又一致熱作用部位,但LPB PGE2的致熱作用是否由EP3受體介導尚需證實。該研究通過AAV介導的shRNA敲低大鼠LPB EP3受體表達的模型,觀察LPB EP3受體表達降低對發熱反應的影響,以研究LPB EP3受體是否介導LPB PGE2的致熱作用以及LPS引起的全身性發熱反應。該研究采用腦立體定位注射的方式將AAV直接注入LPB,并參考文獻[8],選擇注射AAV病毒4周這個時間點觀察病毒轉染和敲低效率。在熒光顯微鏡下,shRNA-EP3組及shRNA-control組大鼠AAV病毒轉染主要集中于LPB腦區,確保了干擾部位的局限性;與shRNA-control對照組相比,shRNA-EP3組大鼠LPB的EP3受體mRNA的表達明顯減少,表明AAV2-shRNA-Ptger3-EGFP病毒有效敲低了LPB的EP3受體表達。shRNA-control 組和shRNA-EP3組大鼠的基礎體溫無明顯差異,LPB微量注射生理鹽水引起2組大鼠均出現核團注射操作引起的Tcore和EE的短暫輕微升高,但2組間無明顯差異,提示,LPB EP3受體未參與基礎體溫的調節以及注射操作引起的應激性體溫升高。往shRNA-control組清醒大鼠LPB注射PGE2引起EE和Tcore明顯升高,其峰值分別出現在給藥后的25 min和30 min,這與先前研究[6]LPB PGE2通過增加產熱,誘導發熱的結果一致。而向shRNA-EP3組大鼠LPB注射PGE2引起清醒大鼠Tcore和EE均僅有輕微升高,與shRNA-control組相比,Tcore升高作用明顯減弱,EE增加也有減弱趨勢,提示EP3受體介導了LPB PGE2的致熱作用。

Oishi et al[9]研究表明,特異性敲除小鼠神經系統的EP3受體,消除了LPS誘導的發熱反應,提示神經系統的EP3受體介導了LPS性發熱。進一步的研究[4]表明,視前區的EP3受體在LPS性發熱中起關鍵作用。另有報道[10]顯示,選擇性抑制環氧化酶-1,減少PGE2生成,可阻斷LPS誘導的發熱反應和LPB等腦區的Fos蛋白(神經元激活標志物)表達。敲除PGE2合成的終端酶mPGES-1也明顯減少了LPS誘導的LPB等腦區Fos蛋白表達。先前實驗[6-7]顯示,腹腔注射LPS后,大鼠LPB的環氧化酶-2與mPGES-1的mRNA和蛋白的表達均明顯上調;而且不管是向雙側LPB注射環氧化酶-2抑制劑減少PGE2的生成,還是應用鵝膏氨酸直接毀損LPB,均減弱了LPS性發熱反應幅度,提示,LPB合成的PGE2可能參與了LPS性發熱,但該過程是否由LPB EP3受體介導尚不清楚。在shRNA-control組中,大鼠腹腔注射LPS引起典型的雙相發熱,體溫分別在2.5 h和5.5 h左右達峰值,這與先前研究[1,6-7]報道的LPS致熱反應一致,說明AAV病毒注射對LPS性發熱沒有影響。在shRNA-EP3組,大鼠腹腔注射LPS后也引起體溫升高,5.5 h體溫明顯高于基礎體溫,但與shRNA-control組相比,發熱反應明顯減弱,腹腔注射LPS后5.5 h的體溫低于shRNA-control組,提示敲低LPB EP3受體表達削弱了LPS引起的發熱,LPB EP3受體部分參與了LPS引起的全身性發熱。

綜上所述,敲低LPB的EP3受體表達不但削弱了LPB局部應用PGE2引起的發熱反應,還減弱了腹腔注射LPS引起的全身性發熱。提示LPB PGE2的致熱作用由EP3受體介導,表明除了視前區EP3受體,LPB的EP3受體也在LPS性發熱中起一定作用。