低溫下有氧運動干預對糖尿病腎病腎臟代謝和短期預后的影響

王琳琳,李志鵬,劉翠蘭,韓小麗,郭寶珠,劉 華,劉圣君

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性并發癥之一,其特征為白蛋白尿排泄持續性增加,隨病程進展,會發展為終末期腎病。據調查[1]顯示,2017年中國成年人群糖尿病的患病率為12.8%,近年來其發病率持續增加,糖尿病腎病發病率也隨之增加[2]。因此,加強糖尿病腎病的防治有著重要意義。既往已有多項研究[3-5]報道長期、規律的有氧運動干預可改善糖尿病腎病患者的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗,在一定程度上抑制腎臟損傷。低溫下有氧運動干預可改善慢性腎臟病3期患者腎功能,降低腎臟預后不良事件發生率[6],但關于其機制鮮有報道。此外,對于糖尿病腎病,低溫下有氧運動干預的效果及短期預后效應也鮮有研究報道。該研究在低溫下進行有氧運動干預,探究其對糖尿病腎病小鼠和患者腎臟代謝的影響及短期預后效應,以期為低溫下有氧運動治療糖尿病腎病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物 40只SPF級雄性DBA/2J小鼠,6～8周齡,體質量20～22 g,購自河北北方學院實驗動物中心[許可證號SYXK(冀)2019-004],室溫22～24 ℃,相對濕度40%～50%,適應性飼養1周。該研究獲該學院實驗動物福利倫理審查委員會批準(批準號:HBNU20200130022092)。

1.1.2病例資料 前瞻性入組河北北方學院附屬第一醫院2020年6—11月的194例糖尿病腎病患者。納入標準:① 有糖尿病史,且滿足以下任意一條:隨機尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin/creatinine ratio,UACR)≥30 mg/g或隨機尿白蛋白排泄率≥30 mg/24 h,且此后3～6個月的3次檢查中2次達到或超過臨界值;估算的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)<60 ml/(min·1.73 m2)3個月以上;病理改變符合糖尿病腎病;② 糖尿病腎病G3A3期;③ 年齡>18歲。排除標準:① 既往有自身免疫性疾病或惡性腫瘤;② 肢體殘疾影響運動;③ 中途退出研究;④ 伴其他原發或繼發性腎小球疾病。該研究遵守《赫爾辛基宣言》,獲該院醫學倫理委員會批準,受試者均簽署知情同意書。

1.1.3主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司,放射免疫沉淀裂解液、二辛可寧酸試劑及化學底物發光液均購自上海碧云天生物技術有限公司,核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)、血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體及二抗均購自艾博抗(上海)貿易有限公司,7020型全自動生化分析儀購自北京日立有限公司,KW-PT型動物實驗跑臺機購自南京卡爾文生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1糖尿病腎病小鼠模型制備、成模標準、分組及干預方案 采用腹腔注射鏈脲佐菌素法(40 mg/kg,連續5次)構建糖尿病腎病模型[7]。糖尿病模型成模標準為隨機血糖>16.7 mmol/L,糖尿病腎病模型成模標準為糖尿病模型成模4周后24 h尿蛋白>30 mg[7]。40只小鼠隨機分為正常組、模型組、低溫組、運動組和低溫運動組,每組8只。除正常組外均造糖尿病腎病模型,此外,運動組和低溫運動組分別在22～24 ℃和3～5 ℃環境下給予為期8周的跑臺運動干預,每天1次,每次1 h,每周連續5 d,速度25 m/min。低溫組僅在運動組和低溫運動組運動時給予3～5 ℃環境干預。期間未給予藥物干預。

1.2.2糖尿病腎病小鼠生化指標檢測 于末次干預后,斷尾法收集血液,用生化分析儀檢測小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和24 h尿蛋白水平。

1.2.3糖尿病腎病小鼠腎臟組織形態觀察 斷尾后,斷頭處死小鼠,分離出腎臟組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后依次切片、脫蠟、水化和HE染色,光學顯微鏡下觀察腎臟病變情況,主要包含腎組織輪廓清晰程度,腎小球和腎小管形態等。每張腎臟病理圖像隨機選取3個非重疊視野,參照文獻[8]進行半定量評分,總分5分,評分越高表明腎臟損傷越嚴重。

1.2.4蛋白質免疫印跡法檢測糖尿病腎病小鼠腎臟組織中NRF2和HO-1水平 取1.2.3中腎臟組織,用放射免疫沉淀裂解液提取腎臟組織中蛋白,用二辛可寧酸法定量;10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,電壓120 V至溴酚藍跑出膠面,電流300 mA轉膜2 h,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;一抗(NRF2和HO-1稀釋比分別為1 ∶500和1 ∶2 000,GAPDH稀釋比1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜;二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h;化學底物發光液顯影。

1.2.5受試者分組及干預方案 根據患者自身情況給予降糖、降壓及糾正脂代謝紊亂等基礎治療,此外,在不改變原有生活習慣的情況下,遵循患者個人意愿,根據低溫有氧運動干預頻次將患者分為運動組(1次/周)、運動組(≥2次/周)和對照組(0次/周)。運動組于2020年12月—2021年3月行低溫有氧運動干預,運動方式為滑冰,運動前進行15 min熱身,然后運動1 h,受試者根據自身情況調整速度和強度,每周至少1次,干預4個月。

1.2.6受試者信息收集 收集年齡、性別、體質指數(body mass index,BMI)、吸煙史、糖尿病病程、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)、冠心病史、高血壓史、是否應用血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)/血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin II receptor blocker,ARB)、二甲雙胍和鈉-葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑(sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor,SGLT2i)類藥物、干預前后的Scr、BUN、尿酸(uric acid,UA)、UACR和eGFR等信息。

1.2.7受試者隨訪 于低溫有氧運動干預結束后用電話和復診方式隨訪1年,每1～3月隨訪1次,將Scr水平翻倍、進展為糖尿病腎病G4期或發生不良心腦血管事件(包含急性冠脈綜合征、心力衰竭、靶血管血運重建及缺血性腦卒中等)定義為預后不良[9]。

2 結果

2.1 糖尿病腎病小鼠的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平與正常組比較,模型組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,運動組和低溫運動組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。與低溫組和運動組比較,低溫運動組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。見表1。

表1 糖尿病腎病小鼠的FBG、Scr和BUN水平

2.2 糖尿病腎病小鼠的腎臟病變情況正常組的組織輪廓清晰,腎小球、腎小管形態規則。與正常組比較,模型組的腎小球肥大,腎小管上皮細胞存在不同程度的壞死,細胞排列混亂。與模型組比較,運動組和低溫運動組的組織形態均有不同程度改善。與低溫組和運動組比較,低溫運動組的腎小球肥大和腎小管擴張程度均減輕。見圖1。正常組、模型組、低溫組、運動組和低溫運動組的腎臟損傷評分[0分、(4.13±0.84)分、(4.00±0.93)分、(2.75±0.46)分和(1.25±0.46)分]差異有統計學意義(F=28.988,P<0.001)。與正常組比較,模型組的腎臟損傷評分升高(P<0.05)。與模型組比較,運動組和低溫運動組的腎臟損傷評分均降低(P<0.05)。與低溫組和運動組比較,低溫運動組的腎臟損傷評分降低(P<0.05)。

圖1 糖尿病腎病小鼠的腎臟病變情況 HE×400

2.3 糖尿病腎病小鼠的NRF2和HO-1水平比較正常組、模型組、低溫組、運動組和低溫運動組的NRF2(1.00±0.03、0.35±0.01、0.32±0.05、1.42±0.05和1.84±0.07)和HO-1(1.00±0.03、0.56±0.01、0.49±0.05、1.15±0.04和1.40±0.04)水平差異均有統計學意義(WelchF=2 642.449、1 093.935,均P<0.001)。與正常組比較,模型組的NRF2和HO-1水平均降低(P<0.05)。與模型組比較,低溫組的HO-1水平降低,運動組和低溫運動組的NRF2和HO-1水平均升高(P<0.05)。與低溫組或運動組比較,低溫運動組的NRF2和HO-1水平均升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 糖尿病腎病小鼠的NRF2和HO-1水平

2.4 糖尿病腎病患者的臨床資料運動組(1次/周)、運動組(≥2次/周)和對照組的年齡、性別構成、BMI、吸煙史、糖尿病病程、HbA1c、冠心病占比、高血壓占比、應用ACEI/ARB、二甲雙胍和SGLT2i類藥物占比差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 糖尿病腎病患者的臨床資料

2.5 糖尿病腎病患者的腎功能指標低溫有氧運動干預前,運動組(1次/周)、運動組(≥2次/周)和對照組的Scr、BUN、UA、UACR和eGFR水平差異均無統計學意義。低溫有氧運動干預后,運動組(1次/周)和運動組(≥2次/周)的BUN和UACR水平均較干預前降低(P<0.05);對照組的Scr、BUN和UACR水平均較干預前升高(P<0.05),eGFR水平較干預前降低(P<0.05);運動組(1次/周)和運動組(≥2次/周)的Scr、BUN和UACR水平均低于對照組(P<0.05),eGFR水平均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 糖尿病腎病患者的腎功能指標

2.6 糖尿病腎病患者的短期預后運動組中短期預后不良5例,其中進展為糖尿病腎病G4期2例,并發急性心肌梗死3例;對照組中短期預后不良18例,其中進展為糖尿病腎病G4期8例,并發不穩定心絞痛3例,急性心肌梗死7例。運動組(≥2次/周)的累積預后不良發生率為2.13%(1/47),低于運動組[1次/周,11.43%(4/35)]和對照組[16.07%(18/112);Log-Rank χ2=6.043,P=0.049]。見圖3。

圖3 糖尿病腎病患者的預后不良發生情況

COX回歸分析結果顯示運動干預1次/周(HR=0.714,95%CI:0.242～2.109)較不干預并不能降低糖尿病腎病患者短期預后不良發生風險,運動干預≥2次/周(HR=0.123,95%CI:0.016～0.925)較不干預可降低糖尿病腎病患者短期預后不良發生風險。

3 討論

糖尿病腎病具有發病率高、治療費用高、預后差等特點,嚴重影響著患者的生活質量和生命安全。據報道[10],全球因糖尿病腎病進展為終末期腎病的患者占30%～50%。在中國,糖尿病腎病已成為中老年人終末期腎病發病的首要原因[11]。在糖尿病腎病發病早期給予及時、有效的干預,可延緩病情進展,甚至逆轉[12]。目前,臨床針對糖尿病腎病的治療主要依靠藥物、透析及腎移植手術等,忽視了運動干預的作用[13]。該研究主要探究低溫下有氧運動干預對糖尿病腎病小鼠和患者腎臟代謝的影響及短期預后效應。

該研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素法構建糖尿病腎病模型,在低溫環境下給予有氧運動干預,結果顯示模型組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均升高,運動組和低溫運動組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均降低,此外,低溫運動組的FBG、Scr、BUN和24 h尿蛋白水平均低于低溫組和運動組。上述結果提示低溫下有氧運動干預可以降低糖尿病腎病小鼠血糖,糾正腎臟代謝異常,其效果優于單純低溫環境干預和室溫下有氧運動干預。此外,腎組織HE染色結果顯示模型組的腎小球肥大,腎小管上皮細胞存在不同程度的壞死,細胞排列混亂,其腎臟損傷評分較正常組升高;運動組和低溫運動組的組織形態均有不同程度改善,兩組腎臟損傷評分均較模型組降低;低溫運動組的腎臟損傷程度低于運動組,其腎臟損傷評分較運動組降低。該結果進一步說明了低溫下有氧運動干預對糖尿病腎病小鼠的腎臟保護作用,其效果優于單純有氧運動干預。

NRF2和HO-1是細胞內抗氧化反應的重要因子,據報道[14-15],激活NRF2/HO-1信號通路可有效降低因高糖環境所產生的活性氧,抑制氧化應激反應誘導的胰島素抵抗,延緩糖尿病腎病進展。該研究結果顯示模型組的NRF2和HO-1水平均降低,運動組和低溫運動組的HO-1和NRF2水平均升高,但低溫運動組的NRF2和HO-1水平更高。上述結果提示低溫下有氧運動干預可上調腎臟組織中NRF2和HO-1表達,其上調效果優于單純有氧運動干預。

為闡明低溫下有氧運動干預對糖尿病腎病患者的作用,該研究用Scr、BUN、UA、UACR和eGFR作為評價腎功能的指標,結果顯示低溫下有氧運動干預后,運動組(1次/周)和運動組(≥2次/周)的Scr、BUN和UACR水平均低于對照組,eGFR水平均高于對照組,該結果提示低溫有氧運動可降低糖尿病腎病患者Scr、BUN和UACR水平,提高eGFR水平,表明低溫有氧運動可改善糖尿病腎病患者腎功能。此外,運動組(≥2次/周)的累積預后不良發生率低于運動組(1次/周)和對照組;COX回歸分析結果顯示運動干預1次/周較不干預并不能降低糖尿病腎病患者短期預后不良發生風險,運動干預≥2次/周較不干預可降低糖尿病腎病患者短期預后不良發生風險。上述結果提示低溫下有氧運動干預可改善糖尿病腎病患者短期預后,其原因可能是低溫下有氧運動可促進NRF2/HO-1信號通路表達,從而抑制糖尿病腎病患者體內炎癥和氧化應激損傷,保護腎功能,改善預后。

綜上所述,低溫下有氧運動干預可糾正糖尿病腎病腎臟代謝異常,保護腎臟組織,降低短期預后不良發生風險,其機制可能與上調NRF2/HO-1軸表達有關。該研究尚存在一定不足,關于低溫下有氧運動與常溫下有氧運動對糖尿病腎病患者的腎功能及預后的保護作用未進行比較,下一步將針對上述不足進行補充,為低溫下有氧運動的開展提供更多依據。