創傷性腦損傷大鼠不同腦區膠質纖維酸性蛋白表達的變化

曹 艷,李恒希,李佳麗,凌騰晗,尹愛平,周 瑩,楊 莉,吳海鷹,李 坪

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是由創傷性事件引起的神經系統損傷性疾病,是較為嚴重的公共衛生問題。研究[1]表明TBI的發病率還在迅速上升。星形膠質細胞是大腦中數量最龐大的膠質細胞,廣泛分布于大腦和脊髓中。生理條件下,星形膠質細胞在支持神經元功能以及維持血腦屏障完整性等方面至關重要[2]。TBI發生后,機械損傷引起星形膠質細胞增生或活化[3],導致星形膠質細胞形態及功能發生異常變化。然而,對于腦創傷后活化星形膠質細胞在不同腦區出現的分布特點、打擊側的表達變化和形態學變化特征以及對側是否被波及影響等依然缺乏報道,因此,研究活化星形膠質細胞對研究TBI后繼發性病理變化以及預后具有重要意義。作為星形膠質細胞特征性標志物的膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是一種中間纖維蛋白,可以調節星形膠質細胞的運動和形狀,提供結構穩定性[4]。因此,在該研究中,主要觀察TBI后星形膠質細胞在不同腦區被激活的形態學變化特點以及GFAP表達情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器兔抗大鼠GFAP單克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術有限公司),即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司),超敏ECL化學發光底物(合肥白鯊生物科技有限公司),大鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司),光學顯微鏡(德國Leica公司),電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司),RNAiso Plus(日本Takara公司)。

1.2 實驗動物SPF級SD雄性大鼠購自昆明醫科大學實驗動物中心,體質量260～280 g,共16只,提前1周飼養于適宜環境(溫度20～25 ℃、濕度55%～65%)中。

1.3 實驗方法

1.3.1分組和模型制備 實驗大鼠隨機分為2組:假手術組(Sham組)和模型組(TBI組)。TBI模型采用改良的Feeney自由落體法進行制備。用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)腹腔麻醉大鼠后,固定于腦立體定位裝置中,頭頂部進行常規消毒后,在冠狀縫下側2 mm和矢狀縫右側2.5 mm處進行直徑約6 mm的開骨窗手術,暴露硬腦膜,將砝碼(40 g)通過銅管從15 cm的高度自由落體式落下,打擊撞擊子至暴露于骨窗的腦組織從而造成TBI,然后迅速拉回砝碼,止血并清理手術區域后,用骨蠟封閉骨窗并縫合皮膚。假手術組大鼠進行相同的開骨窗手術,但不進行打擊。

1.3.2組織樣本處理和收集 腦創傷后2 d[5]進行組織取材,用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)進行腹腔內麻醉,經左心室灌注生理鹽水直至流出的液體清亮,然后用4%多聚甲醛溶液灌注,在冰上解剖取出腦組織,浸入4%多聚甲醛溶液中進行后固定,用于組織學分析。部分腦組織僅用生理鹽水灌注,取出腦組織后放入-80 ℃冰箱保存,用于蛋白質測定分析。

1.3.3免疫組織化學染色 從4%多聚甲醛溶液中取出后固定的腦組織,將組織包埋在石蠟中,用切片機制作成5 μm厚的冠狀切片。選用福州邁新公司的免疫組化S-P法試劑盒進行染色。切片常規脫蠟至水后,通過高溫高壓進行抗原修復15 min,待其冷卻至室溫,PBS沖洗3次,滴加試劑1(內源性過氧化物酶阻斷劑)室溫孵育10 min,PBS沖洗3次,滴加試劑2(非特異性染色阻斷劑)室溫孵育20 min,直接傾去液體,滴加兔抗大鼠GFAP單克隆抗體(1 ∶500)于4 ℃孵育過夜,次日,PBS沖洗3次,滴加試劑3(生物素標記的羊抗兔IgG聚合物)室溫孵育1 h,PBS沖洗3次,滴加試劑4(鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶)室溫孵育15 min,PBS沖洗3次,DAB顯色,梯度酒精脫水、二甲苯透明后,用中性樹膠封固切片,在顯微鏡下進行觀察并采集圖像,使用Image J軟件分析免疫陽性細胞的平均吸光度值。

1.3.4RT-qPCR實驗 從-80 ℃冰箱取出腦組織樣品,使用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA,逆轉錄試劑盒將其合成cDNA后進行PCR反應,采用2-ΔΔCt法計算相對基因表達量。相關引物由上海生工生物有限公司合成,序列如下:GAPDH上游引物為5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′,下游引物為:5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′;GFAP上游引物為:5′-TAAGCTAGCCCTGGACATCG-3′,下游引物為:5′-TACAGGAATGGTGATGCGGT-3′。

1.3.5Western blot實驗 從-80 ℃冰箱取出腦組織樣品,使用RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑)進行勻漿,提取腦組織中總蛋白,BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移到PVDF膜上,在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉膜2 h,4 ℃下將膜與以下一抗孵育過夜:兔抗大鼠GFAP單克隆抗體(1 ∶5 000)、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(1 ∶5 000)。次日,用TBST溶液洗滌PVDF膜后,將膜與HRP結合山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL化學發光底物以及Bio - Rad成像系統檢測蛋白條帶,使用Image J軟件測定各蛋白條帶的灰度值。

1.3.6腦區劃分 研究的腦區共有5個腦區,即:皮質1～4區和中腦區,見圖1。樣品蛋白分為右側皮質總蛋白(包含部位1～4)、左側皮質總蛋白、右側中腦總蛋白(包含部位5)、左側中腦總蛋白。

圖1 大鼠腦區示意圖

2 結果

2.1 TBI后不同腦區GFAP表達的變化通過免疫組化染色對5個腦區中GFAP陽性表達的平均吸光度值進行統計。結果顯示:① Sham左側與Sham右側對比:GFAP陽性表達沒有明顯變化;② Sham左側與TBI左側對比:TBI組的皮質1區與中腦區的GFAP陽性表達有所升高[t=3.15(皮質1區),P<0.05;t=3.50(中腦區),P<0.01];③ Sham右側與TBI右側對比:TBI組各腦區的GFAP陽性表達均有所升高[t=5.98(皮質1區)、3.52(皮質2區)、3.20(皮質3區)、5.61(皮質4區)、7.02(中腦區),P<0.01];④ TBI左側與TBI右側對比:TBI右側的GFAP陽性表達均有所升高[t=5.02(皮質1區),P<0.05;t=3.33(皮質2區),P<0.01;t=2.37(皮質3區)、3.17(皮質4區)、2.86(中腦區),P<0.05](圖2)。提示TBI右側各腦區的星形膠質細胞均發生激活,并且波及到對側(左側)的腦區僅有皮質1區和中腦區。

圖2 不同區域GFAP的表達情況

2.2 TBI后皮質和中腦區GFAP蛋白表達的變化通過Western blot實驗對不同腦區中GFAP蛋白的表達進行統計。結果顯示:(1)在皮質總蛋白中,①

Sham左側與Sham右側比較:GFAP蛋白表達沒有明顯變化;② Sham左側與TBI左側比較:GFAP蛋白表達沒有明顯變化;③ Sham右側與TBI右側比較:TBI組的GFAP蛋白表達出現升高(F=7.751,P<0.05);④ TBI左側與TBI右側比較:TBI右側的GFAP蛋白表達升高(P<0.05)。(2)在中腦總蛋白中,① Sham左側與Sham右側比較:GFAP蛋白表達沒有明顯變化;② Sham左側與TBI左側比較:TBI組的GFAP蛋白表達明顯升高(F=40.03,P<0.01);③ Sham右側與TBI右側比較:TBI組的GFAP蛋白表達明顯升高(P<0.01);④ TBI左側與TBI右側比較:TBI右側的GFAP蛋白表達出現升高(P<0.05)(圖3)。提示TBI右側各腦區GFAP蛋白均出現高表達,并且波及到對側(左側)的中腦區。

圖3 皮質和中腦區GFAP蛋白的表達情況

2.3 TBI后皮質和中腦區GFAP的mRNA表達變化通過RT-qPCR實驗對不同腦區中GFAP的mRNA表達進行統計。結果顯示:(1)在皮質總RNA中,① Sham左側與Sham右側比較:GFAP的mRNA表達沒有明顯變化;② Sham左側與TBI左側比較:TBI組的GFAP mRNA表達出現升高(F=37.26,P<0.05);③ Sham右側與TBI右側比較:TBI組的GFAP mRNA表達出現升高(P<0.01);④ TBI左側與TBI右側比較:TBI右側的GFAP mRNA表達升高(P<0.01)。(2)在中腦總RNA中,① Sham左側與Sham右側比較:GFAP mRNA表達沒有明顯變化;② Sham左側與TBI左側比較:TBI組的GFAP mRNA表達明顯升高(F=301.2,P<0.01);③ Sham右側與TBI右側比較:TBI組的GFAP mRNA表達明顯升高(P<0.01);④ TBI左側與TBI右側比較:TBI右側的GFAP mRNA表達出現升高(P<0.01)(圖4)。提示TBI右側各腦區GFAP mRNA均出現高表達,并且波及到對側(左側)的皮質區和中腦區。

圖4 皮質和中腦區GFAP的mRNA表達情況

3 討論

星形膠質細胞作為大腦組織中數量最多的一種膠質細胞類型,是參與中樞神經系統穩態和血流控制的膠質細胞,為神經元提供結構和功能支持,包括通過細胞外離子濃度調節神經元活化,通過向神經元轉移乳酸調節大腦能量動力學以及通過釋放谷氨酸和三磷酸腺苷等神經遞質調節突觸傳遞。此外,星形膠質細胞在腦損傷后的神經元重建中發揮關鍵作用,包括神經發生、突觸生成、血管形成、血腦屏障修復以及TBI后膠質瘢痕形成等,在疾病的發生、發展及治療過程中起到重要作用[6]。在該研究中,TBI后右側各腦區以及左側的皮質1區和中腦區的星形膠質細胞出現胞體變大、突起增粗的形態學變化,打擊損傷側GFAP蛋白和mRNA表達也明顯增多,以上提示腦損傷大鼠皮質區和中腦區域中星形膠質細胞被激活,表達增多,參與了TBI致傷后的病理變化。查閱文獻[7],在大鼠控制性皮質撞擊損傷模型中,星形膠質細胞在腦損傷后被激活,并且表明在打擊損傷側和對側皮層中均被廣泛激活,出現了與該研究結果相似的變化,當TBI誘導星形膠質細胞過度活化后,會導致繼發性損傷,并引起一系列促氧化作用[7]。該課題組前期研究[8]表明,TBI會引起星形膠質細胞激活,造成GFAP以及炎癥因子TNF-α、IL-1β蛋白表達升高,導致腦水腫、神經功能缺損等病理反應。有文獻[9]也報道星形膠質細胞在腦損傷或其他神經退行性疾病發生后會變得過度激活,這將會導致突觸丟失和選擇性神經元死亡,此外,過度活化的星形膠質細胞釋放細胞毒素,介導毒性水腫和炎癥,并形成瘢痕,抑制軸突再生。這些證據均表明,星形膠質細胞在TBI后繼發性腦損傷中起著關鍵作用。

該研究表明,TBI致傷后星形膠質細胞激活范圍較廣泛,打擊側呈現彌漫性的激活,并可累及對側皮質區,這可能與自由落體打擊腦組織時損傷力量的傳遞有關。有研究[10]報道,顱腦損傷后會出現出血部位腦組織腫脹以及局部低氧等繼發性損傷,從而導致廣泛的軸索變性,迅速累及未打擊部位,從而使原發性損傷加劇。黃樹宣 等[11]研究表明在TBI后第21天,模型組小鼠打擊損傷對側皮層的星形膠質細胞增殖活化依然較對照組顯著增加,這與該研究中結果是一致的,表明腦損傷不僅可以出現在原發的撞擊部位,也可以由近到遠的波及到對側部分腦區。同時,該研究還表明,打擊對側中腦區域的星形膠質細胞同樣出現激活狀態。有文獻報道,在控制性皮質撞擊損傷(CCI)模型中,Li et al[12]使用脂質組學和代謝組學的質譜成像技術追蹤了大鼠腦組織受損后不同區域的變化,分析顯示除了創傷區外,中腦是創傷后彌漫性變化最大的區域。而目前顱腦創傷的研究更多的集中在皮質和海馬部位,中腦區的報道依然較少。

該研究對腦創傷后的星形膠質細胞區域異質性做了初步的探索,未來還可分別對皮質區和中腦區的功能進一步探討,以說明星形膠質細胞在不同腦區中的作用機制。同時,TBI發生后,星形膠質細胞呈現激活,因此,對該細胞進行干預,可能對治療TBI具有重要意義,為TBI的防治提供線索。該研究只選用了一個分子標簽GFAP進行研究,具有一定局限性,因此,后續需要采用多個指標做進一步驗證,以便更為準確地反映星形膠質細胞在大腦各區域的分布情況。