乳源五肽PGPIP緩解酒精性脂肪肝及其機制研究

黃九九,耿奇龍,李安琪,秦宜德,戚 楠

酒精性肝病在人類肝臟疾病中排名前列,根據肝臟損傷的病程差異可分為急性肝損傷和慢性肝損傷,其發(fā)病過程包括早期的肝臟脂肪化,脂肪性肝炎,一些患者最終可能發(fā)展成肝臟纖維化和肝癌。由于酒精性肝病的病因復雜,確切的發(fā)病機制仍不清楚,目前沒有明確預防或治療的方法[1]。生物活性肽和許多抗氧化劑或免疫抑制劑相比,分子量較小,易于通過腸道屏障而被吸收。天然牛乳來源的五肽脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-脯氨酸(prolin-glycine-proline-isoleucine-proline,PGPIP)位于A2β-酪蛋白的63～67殘基上,含有3個Pro,不易被蛋白酶分解,并且所有的氨基酸都是非極性疏水性氨基酸。疏水性氨基酸有助于維持蛋白質的天然構象和功能,疏水相互作用也是多肽和脂蛋白之間結合的重要作用力[2]。慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃小鼠模型是由美國國立衛(wèi)生研究院酒精濫用與酒精中毒研究所(NIAAA)建立的。隨著喂養(yǎng)時間的延長,模型組小鼠發(fā)展出類似人類酒精性肝病的肝臟中性粒細胞浸潤和肝臟纖維化[3]。該研究擬建立NIAAA小鼠模型,并利用其研究乳源五肽PGPIP對酒精性脂肪肝的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 40只清潔級,健康8周齡C57BL/6小鼠,購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號:SCXK(皖)2017-001]。分籠飼養(yǎng)于12 h/12 h晝夜交替,相對濕度45%～55%、溫度20～25 ℃的環(huán)境中,可自由飲水。

1.1.2主要試劑 對照和模型Lieber-DeCarli液體飼料(江蘇南通特洛菲公司);PGPIP(純度>98%)、qRT-PCR引物(上海生物工程有限公司);谷胱甘肽( glutathione,GSH)、蘇木精、4%的多聚甲醛和中性樹膠(江蘇碧云天生物技術公司);無水乙醇(上海蘇懿化學試劑公司);C/EBP同源蛋白質(C/EBP-homologous protein,CHOP)、半胱天冬酶3(Caspase 3)、Cleaved Caspase 3、β-actin抗體(美國Abcam生物技術公司);磷酸化RNA-依賴蛋白激酶樣內質網激酶(P-PERK)、PERK、磷酸化真核翻譯起始因子2α(P-eIF2α)、eIF2α、轉錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和ATF6抗體(美國Cell Signaling生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1NIAAA小鼠模型肝臟內質網應激相關基因差異表達熱圖 NIAAA小鼠模型肝臟RNA測序數據來自美國國家生物技術信息中心(NCBI)的基因表達綜合(GEO)數據庫,檢索號GSE163444[4]。

1.2.2NIAAA小鼠模型的建立 C57BL/6小鼠進行5 d的酒精飼料適應期。對照組小鼠被喂養(yǎng)對照LD液體飼料5 d,實驗組小鼠結束適應期開始喂養(yǎng)含1%酒精的Lieber-Decarli模型液體飼料,每天喂養(yǎng)的酒精濃度增加1%,直到達到5%的酒精濃度為止。隨后小鼠被允許自由飲食,對照組每天繼續(xù)喂養(yǎng)對照液體飼料,實驗組喂養(yǎng)5%酒精濃度的模型液體飼料,分別持續(xù)10 d。實驗期間小鼠每天稱重,檢測健康狀況。在最后1天,實驗組小鼠進行1次5 g酒精/kg體質量的酒精灌胃,對照組小鼠則灌胃同等熱量的麥芽糖糊精。9 h后處死小鼠,收集肝臟組織和血清備用。

1.2.3實驗分組設計 所有小鼠隨機分成4組,每組10只小鼠,分別為:對照LD飼料喂養(yǎng)(對照組)、含酒精模型LD飼料喂養(yǎng)(模型組)、含酒精模型LD飼料喂養(yǎng),同時每天用GSH灌胃(GSH組)、含酒精模型LD飼料喂養(yǎng),同時每天用PGPIP灌胃(PGPIP組)。所有小鼠在慢性酒精液體飼料喂養(yǎng)加急性酒精灌胃后都存活下來。GSH組和PGPIP組,每天在最后1天酒精灌胃之前30 min的同樣時間,分別灌胃4×10-6mol/kg體質量的GSH和PGPIP。對照組和模型組,每天灌胃同等體積的去離子水。

1.2.4組織學分析 取小鼠新鮮肝臟放置4%多聚甲醛中固定24 h以上。固定結束后放入自動組織脫水機中脫水,石蠟包埋機包埋,石蠟切片厚度為5 μm,切片烘干后脫蠟。蘇木精染細胞核,鹽酸酒精分化,碳酸鋰反藍,伊紅染細胞質。中性樹膠封片觀察。

1.2.5油紅O染色 通過油紅O染色確定肝臟脂肪化。取小鼠新鮮肝臟置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。將固定好的小鼠肝組織置于蔗糖溶液中脫水,PBS清洗組織表面的蔗糖溶液,OCT包埋劑包埋肝組織。切片厚度為10 μm,干冰冷凍后,切片置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ图tO工作液按照3 ∶2比例配置,取30 ml油紅O染色儲備液與20 ml的去離子水混勻,靜置10 min后,過濾,現配現用。冰凍切片用油紅O工作液避光染色10 min,異丙醇分化,蘇木精染細胞核,鹽酸酒精分化,碳酸鋰反藍。甘油明膠封片觀察。

1.2.6透射電鏡分析 取材器械提前在4 ℃冰箱內預冷,取新鮮小鼠肝臟,切成大小為1 mm3左右或橫切面為1 mm2的長條形,將組織放入2.5%戊二醛固定液內于4 ℃冰箱內前固定,磷酸緩沖溶液漂洗,1%鋨酸于4 ℃冰箱內后固定,滲透包埋后,切片厚度為70 nm,枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察拍照。

1.2.7qRT-PCR實驗 各處理組小鼠肝臟組織剪碎研磨后用TRIzol試劑盒提取組織總RNA,然后逆轉錄成cDNA。目的基因的mRNA表達水平用GAPDH作為內參定量測定。每組設置3個復孔,目的引物序列見表1,根據實驗結果獲得Ct值,目的基因mRNA的表達水平用2-ΔΔCt方法定量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8Western blot實驗 取新鮮小鼠肝臟,剪切成細小的碎片,按照每20 mg組織加入200 μl RIPA裂解液裂解。裂解液經過蛋白濃度定量后,等量的蛋白(20 μg)加到上樣孔中進行SDS-PAGE凝膠電泳。Western blot轉膜后,用含5%的脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h,一抗1 ∶1 000 TBST稀釋后4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后,辣根酶標記的二抗1 ∶1 000 TBST稀釋后37 ℃孵育1 h,顯色。

2 結果

2.1 NIAAA小鼠模型肝臟內質網應激相關基因差異表達分析為了探索NIAAA小鼠模型肝臟中酒精代謝對內質網應激的影響,選取酒精代謝酶細胞色素P4502E1(CYP2E1)和非折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR)經典通路相關基因,根據已有的GEO數據庫中RNA測序數據進行聚類熱圖分析,其中對照組和模型組各選取3只小鼠肝臟樣本數據,結果如圖1所示,對照組和模型組樣本之間生物重復性較好,ATF4、CHOP、ATF6和PERK基因在對照組肝臟樣本中表達相對較低,而在模型組樣本中表達相對較高。

圖1 NIAAA小鼠模型肝臟RNA測序基因差異表達熱圖

2.2 各處理組對小鼠酒精性肝損傷的病理學影響HE常規(guī)染色如圖2所示,正常對照組小鼠在中央靜脈周圍分布著放射狀的肝細胞,形成肝細胞索。肝小葉結構清晰,肝細胞索排列整齊。模型組小鼠肝細胞索排列紊亂,肝細胞出現重度脂肪變性,表現為大脂肪泡和小脂肪泡相間的混合型脂肪病變。此外,肝小葉間可見不同程度的炎癥細胞浸潤。GSH組小鼠肝細胞脂肪變性程度和模型組類似。PGPIP組小鼠肝細胞脂肪病變程度比模型組和GSH組小鼠明顯減輕,肝小葉結構完整。

2.3 各處理組對小鼠肝臟脂滴積累的影響油紅O染色如圖3所示,正常對照組小鼠肝臟中可見較少的脂滴,與之相比,模型組小鼠肝臟中有明顯的脂滴積累,表現為大小不同程度的混合型脂滴,GSH組小鼠肝臟與模型組相似,但脂滴的尺寸有所減少。PGPIP組小鼠肝臟脂滴數目與模型組和GSH組相比明顯減少,與對照組類似。

圖3 各處理組對慢性酒精性脂肪肝模型脂滴積累的影響 ×200

2.4 各處理組對肝細胞顯微形態(tài)的影響為了進一步分析酒精代謝引起的脂滴積累對肝細胞顯微結構的影響并驗證PGPIP的作用效果,對各處理組小鼠肝臟進行透射電子顯微鏡分析。結果如圖4所示,對照組小鼠肝細胞細胞質膜邊界明顯,細胞核結構清晰,呈橢圓形,周圍圍繞著許多大小不等的線粒體,線粒體的周圍可見內質網。細胞內僅有少量的脂滴存在,且脂滴的尺寸較小。模型組小鼠肝細胞細胞膜邊界模糊,肝細胞胞質空間被許多較大的脂滴占據(大于5 μm),此外還有一些小的脂滴。肝細胞細胞核有明顯的形態(tài)改變,可能是由于周圍大脂滴的擠壓所致。與模型組類似,GSH組小鼠肝細胞中也有較大的脂滴(大于5 μm)。PGPIP組小鼠肝細胞脂滴的數目和尺寸明顯減少,細胞核重新恢復成橢圓形,細胞內可見許多線粒體和線粒體周圍的內質網。

圖4 各處理組對慢性酒精性脂肪肝模型肝細胞顯微結構的影響 ×1 600

2.5 PGPIP調節(jié)肝臟中內質網應激相關基因的表達通過qTR-PCR,分析各處理組小鼠肝臟組織中和內質網應激相關的CHOP和Bip mRNA的表達。通過Western blot分析內質網應激相關的P-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF4、ATF6、CHOP、Cleaved Caspase 3和Caspase 3蛋白。結果如圖5所示,與對照組相比,模型組中CHOP mRNA表達水平顯著增加,PGPIP恢復了表達水平的改變。與對照組相比,模型組中P-PERK、P-eIF2α、ATF4、ATF6、CHOP、Cleaved Caspase 3和Caspase 3蛋白的表達水平顯著增加,但PERK、eIF2α的蛋白表達水平并沒有顯著性改變。PGPIP肽能夠顯著恢復酒精誘導的上述蛋白表達水平的增加,并且PGPIP對PERK和eIF2α的蛋白表達水平沒有明顯影響。此外,結果顯示,與對照組相比,模型組中P-PERK/PERK和P-eIF2α/eIF2α的磷酸化水平顯著增加,然而PGPIP恢復了磷酸化水平的改變。因此,PGPIP對PERK-eIF2α-ATF4通路有較大影響,且對ATF6和Cleaved Caspase 3蛋白的表達有顯著性的效果。

3 討論

肝臟是人體酒精代謝的主要器官,肝細胞中負責酒精代謝的酶類主要有兩種,乙醇脫氫酶和CYP2E1。CYP2E1主要定位于肝細胞的內質網,肝細胞的內質網還發(fā)揮許多重要的生物學功能,包括胞質共翻譯蛋白質折疊,調節(jié)鈣離子平衡和脂類的生物合成。內質網內的氧化還原環(huán)境是通過GSH氧化還原產物的比率來維持的。在慢性重度酒精性肝病患者體內,CYP2E1基因被大量誘導表達,催化乙醇轉變成乙醛,同時生成大量活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)[5]。過量的ROS能夠氧化內質網內的蛋白質和脂質,改變內質網內的氧化還原環(huán)境,導致蛋白質折疊錯誤[6]。在內質網腔中錯誤折疊/未折疊的蛋白質和內質網折疊機器之間平衡被打破,導致錯誤折疊/未折疊的蛋白質聚集,引起內質網應激。在內質網應激發(fā)生時,GSH氧化還原產物的比率改變,進一步增加ROS產生,改變內質網內的氧化還原環(huán)境。

肝細胞中脂質積累是酒精性肝病早期的主要特征之一,積累的脂質主要以磷脂單層膜包裹的脂滴的形式存在,脂滴中心則是由富含三酰甘油的疏水的中性脂質組成的內核。參與三酰甘油合成的脂肪酸的來源,有食物來源的,脂肪組織經過脂解后釋放進入血液的,以及肝細胞通過脂肪酸合成途徑生成的。慢性飲酒會促進脂肪組織脂解,并且促進肝細胞合成脂肪酸[3]。在肝細胞中,脂肪酸被運輸到內質網合成三酰甘油,繼而從內質網以脂滴的形式出芽進入細胞質[7]。過多的脂肪酸進入內質網,超出了內質網的三酰甘油合成載量,在內質網中積累會導致內質網應激。在酒精性肝病小鼠模型中,肝細胞特異性敲除主要表達于內質網膜上的甘油二酯酰基轉移酶1,一種三酰甘油合成的限速酶,會促進肝臟脂肪酸合成,生成過多的脂肪酸繼而誘導內質網應激,而降低肝臟脂肪酸水平能夠抑制內質網應激[8]。

內質網應激發(fā)生時,啟動UPR,通過減少蛋白質翻譯,增加蛋白質折疊,以及促進錯誤折疊/未折疊的蛋白質降解,恢復內質網平衡。UPR包含3種經典信號轉導通路,被3種通常稱為UPR感受器的內質網跨膜蛋白起始,包括肌醇需求酶1-α(IRE1α)、PERK、ATF6。在生理條件下,UPR感受器的內質網腔面結構域和內質網固有伴侶相互作用并結合,特別是BiP/GRP78蛋白。當未折疊/錯誤折疊的蛋白質積累在內質網腔內,它們就結合并飽和Bip,競爭性使BiP從UPR感受器的內質網腔面結構域解離,繼而導致后者寡聚化并激活。PERK激活后,通過磷酸化激活eIF2α,選擇性誘導激活ATF4。已有研究[9]報道酒精性肝病小鼠模型在肝臟中激活PERK/eIF2α/ATF4信號通路,并誘導脂肪酸合成相關基因的表達,導致肝臟脂肪化,提示內質網應激會促進脂肪酸的合成。轉錄因子ATF4和ATF6激活后進入細胞核,誘導CHOP的表達[10-13]。在內質網應激誘導的肝細胞凋亡過程中,CHOP表達并在細胞核內積累[14]。CHOP并不直接誘導凋亡,而是激活Caspase 3起始凋亡通路[15]。剪切后激活的Caspase 3切割細胞核和細胞質中的活性蛋白質,導致肝細胞凋亡。凋亡的肝細胞作為損傷相關的分子模式進一步促進酒精性肝病的發(fā)展。目前的結果顯示PGPIP顯著性減少PERK/eIF2α通路磷酸化水平和ATF6表達水平,導致CHOP表達顯著性減少。減少的CHOP表達導致Caspase 3的激活減少,因此減少了內質網應激,從而緩解酒精性脂肪肝。綜上所述,PGPIP在酒精性肝病的防治過程中起到較大作用,且PGPIP具有副作用小、成本低廉、分子量小、不易引起免疫反應、可口服等多種方式給藥等優(yōu)點,但其更為詳細的分子機制還需進一步研究。