熒光法測定菠菜焯水過程中維生素B2的流失
——熒光法測定維生素B2的實驗拓展

黃洋祺，李譽，李常耕，朱顏，孫維嘉，范春涵，李琰，丁飛，張曉光，孔德明

南開大學化學學院，南開大學實驗教學中心，天津 300071

維生素B2(Vitamin B2，簡稱VB2)是一種水溶性維生素，是人體內很多重要酶的組成成分，在維持人體代謝中起著重要作用。缺乏VB2會影響人體細胞的生長和機體的生物氧化，使代謝發生障礙，導致口、眼和外生殖器部位的炎癥，如口角炎、唇炎、舌炎、眼結膜炎和陰囊炎等[1-3]。由于人體自身無法產生VB2，只能通過食物等外界來源攝取，因此對食源性VB2的研究具有重要意義。

VB2的分子式為C17H20N4O6，擁有三個芳香環(圖1)。分子的平面剛性結構賦予了VB2較強的熒光性質，其最大的熒光發射波長大約在525 nm左右。“熒光法測定VB2的含量”是很多大學儀器分析課程的常用本科教學實驗[4]。其基本的實驗流程是在最佳的激發和發射波長下測定VB2標準溶液的熒光強度，利用熒光強度與濃度的線性關系制作標準曲線。在相同條件下測定未知溶液的熒光強度，并利用制作的標準曲線計算出未知溶液中VB2的含量。通過該實驗，可以加深學生對分子熒光的理解，了解熒光光譜儀的基本結構，掌握儀器的基本使用步驟及熒光定量分析的基本操作，對于輔助儀器分析教學至關重要。但作為一個本科教學實驗，其設計過于簡單、實驗內容偏少，學生往往很快就完成了全部實驗內容。不僅使學生得不到充分的鍛煉，而且無法凸顯熒光分析法在人類生產和生活中的強大實際應用能力。為此，在原有實驗內容的基礎上開展進一步設計，拓展實驗項目，開發內容更為豐富、且實驗時間和操作難度適宜的本科教學實驗，對于提升實驗教學效果至關重要。

圖1 VB2的化學結構式

很多食物，包括動物肝臟、肉類、蛋類、奶及奶制品中都含有大量的VB2。蔬菜也是人們獲取VB2的一個重要來源，部分蔬菜的VB2含量如表1所示。菠菜是一種比較常見的蔬菜，每100 g菠菜中VB2的含量大約為0.11 mg[5]，屬于VB2含量較高的綠色蔬菜。但由于菠菜中含有大量的草酸(0.2-0.3 g/100 g)，食用之后會與人體內的鈣、鎂發生反應，生成草酸鈣和草酸鎂等難以消化的物質。不僅不利于人體健康，長期食用還有可能引發結石。因此，在食用前通常需要對菠菜進行焯水處理以去除草酸[6]，這一過程不可避免地會造成VB2的流失。本實驗證明，利用熒光分析法可以考察菠菜焯水過程中VB2的析出情況。相關實驗有望作為目前本科教學實驗的一個拓展，不僅可以豐富教學內容，而且使實驗更加貼近于人們的實際生活。有助于提升學生的學習興趣，加深對所學內容的理解。

表1 部分蔬菜中VB2的含量(mg/100 g)

1 實驗部分

1.1 實驗原理

熒光是一種光致發光現象。熒光物質分子在吸收了特定波長的紫外光或可見光能量之后，從基態躍遷至相應的激發態。在通過振動馳豫和內轉化等非輻射途徑損失掉一部分能量后，積累到第一電子激發單重態的最低振動能級，再從該能級向基態的各個振動能級躍遷，產生分子熒光。在一定濃度范圍內，熒光強度(F)與熒光物質濃度(C)之間成正比關系(F=kC)，借此可以進行定量分析。

能夠發出熒光的物質通常具有剛性平面和大共軛結構。VB2分子中由于存在由三個芳香環構成的共軛體系，且結構剛性，因此顯示了良好的熒光性質。利用VB2產生的熒光信號，可以對菠菜焯水過程中釋放出來的VB2進行定量分析，進而計算出該過程中VB2的流失率。

1.2 試劑和材料

1.00 μg·mL-1VB2標準貯備液：準確稱取1.00 mg VB2，將其溶解于含有1%乙酸的蒸餾水中。轉移至1 L容量瓶，并用含有1%乙酸的蒸餾水定容至刻度、搖勻。分裝于棕色瓶中避光保存備用。

新鮮菠菜葉片：購于當地菜市場。

1.3 實驗儀器

Shimadzu RF-5301PC型熒光光譜儀(日本島津)、電加熱套、Sartorius電子天平(德國賽多利斯)、25 mL比色管、10 mL離心管、5 mL移液管、500 mL錐形瓶、移液器。

1.4 實驗內容

1.4.1 VB2標準系列溶液的配制

準確移取0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL的VB2標準貯備液于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。

1.4.2 菠菜焯水實驗

(1) 選取新鮮的菠菜葉片，洗凈，用吸水紙去除表面水分，晾干或用吹風機吹干備用。

(2) 向500 mL錐形瓶中加入400 mL蒸餾水，在電熱套上加熱至沸騰。此過程中將錐形瓶蓋上錫紙以減少熱量和水分損失。

(3) 準確稱取40 g左右菠菜葉片，并快速加入至錐形瓶中，開始計時。每1 min用移液器從中取出2.5 mL水溶液至離心管中，冷卻至室溫備用。5 min后停止加熱，此時取出兩份水溶液，一份編號入上述的取出液系列，一份用于繪制取出液的熒光光譜。

1.4.3 熒光光譜的繪制

從1.4.1配制的標準溶液中選取一個濃度較大的用于熒光光譜的繪制。具體步驟如下：以525 nm作為發射波長繪制激發光譜，確定最佳激發波長。再用該激發波長繪制發射光譜，確定最佳發射波長。使用相同的步驟，繪制焯水5 min取出液的激發和發射光譜，并確定其最佳激發波長和最佳發射波長。此過程中，激發和發射狹縫分別設置為5 nm和3 nm。

1.4.4 菠菜中VB2流失率檢測

分別選取463 nm和526 nm為激發和發射波長，依次測定1.4.1中VB2標準系列溶液的熒光強度。以熒光強度為縱坐標，VB2濃度為橫坐標繪制標準曲線。在相同激發和發射波長下，測定1.4.2中每個焯水時間點下取出液的熒光強度。利用繪制的標準曲線計算出各取出液中VB2的濃度，進而計算出各個時間點下析出的VB2質量及流失百分率。

其中，菠菜中VB2總質量按每100 g菠菜中含0.11 mg VB2計算。

2 結果與討論

2.1 熒光分析法用于菠菜焯水研究的可行性

VB2為水溶性維生素，室溫下的溶解度為12 mg/100 mL。加熱時，VB2在中性或酸性條件下具有較高的穩定性。也就是說，在焯水過程中，菠菜中的VB2可以釋放到熱水中，并在熱水中穩定存在。因此可以推測，利用熒光分析法，可以對焯水過程中釋放到水里的VB2含量變化進行監測，進而計算出VB2析出量隨焯水時間的變化。為證明這一點，準確稱取一定量(40.45 g)的菠菜進行焯水處理(圖2)。為減少焯水過程中因水分蒸發所造成的體積損失，選用錐形瓶作為容器，并在實驗過程中用錫紙密封錐形瓶口，只在取樣時短暫打開。選取焯水5 min的取出液進行熒光光譜的繪制，并與VB2標準溶液進行對比。結果如圖3所示，該取出液具有熒光性質，其最大激發波長(λex)和最大發射波長(λem)分別為463 nm和525 nm，與VB2標準溶液(λex= 466 nm，λem= 526 nm)非常接近。雖然菠菜中同時存在草酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜素和視黃醇等物質，但它們或者沒有熒光，或者激發波長和發射波長與VB2差別較大。因此可以推斷，圖3b中所示的熒光信號是由菠菜焯水過程中析出的VB2所引起的。利用熒光光譜，可以對析出的VB2進行定量檢測。

圖2 (a) 菠菜樣品；(b) 焯水裝置；(c) 焯水不同時間的取出液

圖3 VB2標準溶液(0.08 μg·mL-1) (a)和菠菜焯水5 min取出液(b)的激發和發射光譜

2.2 標準曲線繪制

測定VB2標準系列溶液的熒光強度，并繪制標準曲線。由于VB2標準溶液與菠菜焯水取出液的最大激發波長和發射波長略有不同，為使繪制的標準曲線適用于菠菜焯水取出液中VB2的定量分析，對激發和發射波長進行了折中選取。從圖3可以看出，無論是標準溶液還是焯水取出液，在激發光譜中，熒光強度在最大激發波長前變化較緩，在最大激發波長后迅速下降，因此選擇較小的463 nm作為激發波長。由于熒光光譜的對稱性，發射光譜給出了相反的趨勢，即熒光強度在最大發射波長前變化較大，在最大發射波長后變化減緩，因此選擇較大的526 nm作為發射波長。在選取的激發和發射波長下，繪制的標準曲線如圖4所示。在0.02-0.10 μg·mL-1的濃度范圍內，熒光強度與VB2濃度呈現良好的線性關系。線性回歸方程為F= 5203.13C(μg·mL-1) - 1.96，線性相關系數(R2)為0.9987。

圖4 VB2熒光分析的標準曲線

2.3 菠菜焯水過程中VB2的析出研究

將不同焯水時間點的取出液冷卻至室溫，在與繪制標準曲線相同的實驗條件下測定熒光強度，并利用前面得到的標準曲線計算出每個時間點下取出液中VB2的濃度，進而計算出該時間點下VB2的總析出量。注意，在進行VB2總析出量計算時，需要把前面各時間點取出液中含有的VB2計算在內。舉例而言，計算焯水3 min時VB2的總析出量，需要加上第1 min和第2 min取出液(各2.5 mL)里的VB2(各自時間點下取出液中VB2濃度 × 2.5 mL)。以每100 g菠菜中含有0.11 mg VB2計算，40.45 g菠菜中含有的VB2總量為0.04450 mg (44.50 μg)。利用此數據，可以計算出各個時間點下VB2的流失率。從表2和圖5可以看出，在焯水過程中，VB2快速從菠菜中析出。在焯水1 min和2 min時，VB2的析出百分率分別為44.65%和62.74%。在0到1 min的時間段，VB2的析出速率最快。在1到2 min的時間段，仍保留了較快的析出。其中一個原因是當菠菜剛加入沸水中時，會使體系的溫度下降。也就是說，在開始的1 min內，有一段時間錐形瓶中的水并沒有處于沸騰狀態，導致VB2未能充分析出。2 min后，VB2的析出速率變緩。當焯水時間為5 min時，VB2的析出百分率為73.82%。將焯水時間繼續延長至10 min時，VB2的析出百分率達到76.66%。從以上結果可以看出，由于VB2在沸水中具有較高的溶解度，在焯水過程中，VB2極易從菠菜中析出。當焯水時間為3 min時，大約2/3的VB2將會進入到水中而流失。當焯水時間為5 min時，大約3/4的VB2將會析出。在此基礎上繼續延長焯水時間，對VB2的析出影響不大。考慮到人們在實際生活中并不會對菠菜進行過長時間的焯水，大約有1/2-1/3的VB2會保留在菠菜當中。從以上實驗結果可以看出，雖然菠菜是VB2含量相對較高的一種綠色蔬菜，但由于食用前往往需要焯水處理以去除草酸，會造成一半以上的VB2流失，導致人們實際攝入的VB2并不多。平行進行三組實驗以驗證分析結果的重現性。實驗結果表明(圖5)，該方法重現性良好，除在VB2快速析出階段(0-3 min)相對偏差較大外(～7%)，其他階段，尤其是析出平衡階段，偏差均在5%以內。

表2 不同焯水時間下VB2的流失率

2.4 將實驗內容應用于本科教學的可行性

該實驗可以有效克服原有實驗內容偏少、學生得不到充分鍛煉的問題。在原有實驗基礎上加入本部分內容后，全部實驗可以在4個學時之內完成。另外，該部分實驗內容對儀器設備要求簡單，只需要引入化學實驗室常備的電子天平、電熱套和錐形瓶即可。以上特點使其尤其適用于本科實驗教學。在兩個學期的試運行中，學生普遍反映良好，被譽為印象最為深刻的儀器分析實驗。學生給出了如下評價：實驗既貼近生活，易于操作，又新穎有趣，通過實驗，我們對理論知識有了更深的理解；實驗揭示了有關菠菜焯水過程中維生素的流失情況，對指導我們的生活頗有意義；實驗在原有課程實驗的基礎上，以分析技術證明生活中蔬菜焯水對某些營養素的影響，更加貼近生活；實驗對原有課程進行了豐富補充，實驗內容安全有趣，能夠與日常生活緊密聯系，起到對學生在學以致用方面的提示作用；實驗生動有趣，與人們的生活密切相關，通過該實驗，對將分析技術應用于人類生活有了更為深入的理解。

3 結語

在證明熒光分析法可以用于分析菠菜焯水過程中VB2流失情況的基礎上，提出將該實驗內容豐富到本科教學實驗“熒光法測定維生素B2”的實驗教學改革思路。這一改革思路具有如下優點：(1) 豐富了實驗內容，克服了原有實驗內容偏少、學生鍛煉不足的問題；(2) 實驗內容新穎有趣，既有利于提升學生的學習興趣，又有利于加深學生對課堂知識的理解；(3) 研究內容貼近生活，有利于幫助學生培養學以致用的能力；(4) 實驗時長適宜，對儀器要求低，使用化學實驗室的常備儀器即可完成，尤其適用于推廣為本科教學實驗。