基于鎳納米團(tuán)簇-銪混合物的紙基比率熒光傳感器檢測(cè)四環(huán)素
——推薦一個(gè)研究型綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)

王宇琳，陳錦婷，韓煒田，丘秀珍

韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005

近年來，由于金屬納米團(tuán)簇(MNCs)具有誘人的特性(如優(yōu)越的光穩(wěn)定性、低生物毒性和簡(jiǎn)單的合成程序)而受到廣泛關(guān)注[1-3]。鎳和金銀相比，價(jià)格便宜，資源豐富，是合成金屬簇的良好材料。另一方面，鑭系元素的銪離子(Eu3+)具有未被完全充滿的4f電子層結(jié)構(gòu)，易與氧、氮原子配位形成具有獨(dú)特?zé)晒庑阅?明亮的可見光發(fā)射)的配位化合物，作為一種新興比率型熒光傳感器被廣泛應(yīng)用[4,5]。如銪離子(Eu3+)與四環(huán)素類藥物(tetracyclines，TCs)配位結(jié)合后，在620 nm處發(fā)出明亮的紅光[6,7]。

因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種基于鎳納米團(tuán)簇-銪混合的紙基比率熒光傳感器用于四環(huán)素檢測(cè)。該熒光傳感器在430 nm和620 nm處熒光強(qiáng)度比值與分析物的濃度成線性關(guān)系，且制備的紙基比率熒光傳感器[8]可通過顏色變化可視化識(shí)別環(huán)境水體中的TCs。通過該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，學(xué)生不僅能夠掌握紫外-可見分光光度計(jì)和分子熒光光譜儀的使用方法和原理，而且還可學(xué)到分析和處理復(fù)雜數(shù)據(jù)的能力。同時(shí)，學(xué)生通過試紙顏色變化識(shí)別TCs含量，能夠讓學(xué)生體驗(yàn)到一個(gè)“看得見”的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)[9,10]。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 掌握該比率熒光傳感器的設(shè)計(jì)思路、合成方法、分析檢測(cè)原理。

(2) 了解紫外-可見分光光度計(jì)和分子熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)和原理，掌握儀器的基本操作。

(3) 學(xué)會(huì)運(yùn)用各種軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理如圖1所示。首先合成的NiNCs在430 nm處發(fā)藍(lán)色熒光，加入Eu3+溶液后，由于誘導(dǎo)聚集效應(yīng)，NiNCs發(fā)光強(qiáng)度減弱。然后，將TCs加入到NiNCs-Eu3+混合溶液后，由于內(nèi)部過濾效應(yīng)(IFE)，430 nm處的藍(lán)色熒光淬滅，TCs通過“天線效應(yīng)”將所吸收的能量有效地傳遞給Eu3+，形成發(fā)紅色熒光的Eu-TCs配合物，在620 nm處出現(xiàn)明顯熒光特征峰。隨著TCs溶液濃度增加，430 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，620 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大，且I620nm/I430nm值與待測(cè)目標(biāo)物TCs濃度呈線性關(guān)系，可用于水體中TCs的含量檢測(cè)。

另外，將浸泡有NiNCs-Eu3+的濾紙構(gòu)建成便攜式紙基熒光傳感器，對(duì)于不同濃度的四環(huán)素(TC)和土霉素(OTC)，紙基傳感器的獨(dú)特?zé)晒忸伾珡牧了{(lán)色到紅色，可用于水體中TCs的可視化識(shí)別。

圖1 紙基熒光傳感器的設(shè)計(jì)和應(yīng)用原理

3 試劑與儀器

聚乙烯吡咯烷酮(高級(jí)純，PVP)、L-抗壞血酸(99%，L-AA)、醋酸銪(99.9%，Eu(OOCCH3)3)、土霉素(99.99%，OTC)、鹽酸四環(huán)素(99.99%，TC)、金霉素(99.99%，CTC)、谷胱甘肽(98%，GSH)、L-谷氨酸(99%，L-Glu)、L-組氨酸(99%，L-His)和D-色氨酸(99%，D-Try)購(gòu)置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。NiCl2·6H2O、NaOH、HCl、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、NaCl、ZnCl2、AlCl3、MgCl2和CuCl2均為分析純，購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。濾紙購(gòu)置于Whatman公司。

分子熒光光譜儀(F-380，天津港東科技股份有限公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(UV-650，上海美譜達(dá)儀器有限公司)，便攜式紫外箱，渦旋振蕩器(Vortex2，德國(guó)IKA)，磁力攪拌器。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 NiNCs的合成

首先，將1 g PVP超聲溶解在15 mL超純水后，滴加NaOH溶液(1.0 mol·L-1)將溶液的pH調(diào)節(jié)為～10.0。接著，向上述混合溶液中加入L-AA (2 mL，100 mmol·L-1)和NiCl2·6H2O (0.2 mL，100 mmol·L-1)并在25 °C攪拌6天。當(dāng)溶液的顏色由無色變成淺黃色后，表明NiNCs的形成。將獲得的NiNCs儲(chǔ)存在4 °C以供進(jìn)一步使用。

4.2 比率熒光傳感器檢測(cè)TC和OTC

向NiNCs (50 μL)和Eu3+(100 μL，100 mmol·L-1)混合溶液中加入500 μL不同濃度的TC和OTC溶液(0.00、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 μmol·L-1)。待振蕩反應(yīng)10 min后，在激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm下記錄熒光發(fā)射光譜。研究熒光強(qiáng)度比(I620nm/I430nm)與不同濃度的TC和OTC之間的關(guān)系。

4.3 紙基熒光傳感器的制備

用濾紙剪成直徑為1 cm的試紙，將試紙充分浸入NiNCs (50 μL)和Eu3+(100 μL，100 mmol·L-1)的混合溶液10 min，然后在空氣中干燥。移取500 μL不同濃度的TC和OTC溶液(0.00、0.50、5.00、10.00、30.00、50.00 μmol·L-1)滴加到浸泡有NiNCs-Eu3+的試紙上，在365 nm紫外光下觀察試紙顏色變化構(gòu)建紙基熒光標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

4.4 紙基熒光傳感器識(shí)別環(huán)境水樣品中TCs

取環(huán)境水樣(校園湖水和自來水)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，分別加入不同濃度的TC和OTC (5.00、30.00、50.00 μmol·L-1)。將500 μL加標(biāo)樣品溶液滴到浸泡有NiNCs-Eu3+的試紙上，在365 nm紫外光下觀察試紙顏色變化，通過紙基標(biāo)準(zhǔn)比色卡識(shí)別水樣中TCs的含量。

5 結(jié)果與討論

5.1 NiNCs-Eu3+對(duì)TCs的熒光響應(yīng)機(jī)理

在NiNCs (50 μL)和Eu3+(100 μL，100 mmol·L-1)混合溶液中加入500 μL不同濃度的TC和OTC溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)和分子熒光光譜儀研究NiNCs-Eu3+對(duì)TCs的熒光響應(yīng)機(jī)理。如圖2A、B可知，NiNCs在365 nm的激發(fā)下顯示出430 nm處的強(qiáng)藍(lán)色熒光。當(dāng)加入Eu3+溶液后，由于誘導(dǎo)聚集效應(yīng)，NiNCs在430 nm處的熒光被淬滅。接著向NiNCs-Eu3+混合溶液中加入TC，由于內(nèi)部過濾效應(yīng)，它們?cè)?30 nm處的熒光減弱。但在620 nm處出現(xiàn)了明顯的Eu3+特征紅色發(fā)射峰[11]，這是因?yàn)門C吸收的能量可以通過“天線效應(yīng)”有效地轉(zhuǎn)移到Eu3+，從而導(dǎo)致與NiNCs-Eu3+系統(tǒng)相比，Eu3+發(fā)射光強(qiáng)度增強(qiáng)[12]。從圖2A發(fā)現(xiàn)NiNCs-Eu3+-TC在620 nm處的熒光強(qiáng)度是Eu3+-TC的近7倍。說明NiNCs可以通過金屬增強(qiáng)熒光效應(yīng)(MEF)進(jìn)一步增強(qiáng)Eu3+-TC的熒光強(qiáng)度。

5.2 比率熒光傳感器對(duì)不同濃度TCs的識(shí)別性能

為研究NiNCs-Eu3+對(duì)TCs的識(shí)別性能，分別將一系列不同濃度的TC和OTC溶液添加到NiNCs-Eu3+的混合溶液中。如圖3A、C所示，在365 nm的激發(fā)下，隨著TC和OTC濃度的增加，430 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減少，而620 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大。如圖3B、D所示，I620nm/I430nm的值隨著TC和OTC濃度(0.10-50.00 μmol·L-1)的增加呈線性遞增，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.9937和0.9984，滿足分析方法學(xué)要求。根據(jù)檢出限計(jì)算公式LOD = 3σ/S，算得該方法對(duì)TC和OTC的LOD分別為27 nmol·L-1和19 nmol·L-1。說明該比率熒光傳感器可用于TC和OTC的定量分析。

圖3 NiNCs-Eu3+對(duì)不同濃度(0.00、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 μmol·L-1)的TC(A)和OTC (C)溶液的熒光響應(yīng)以及I620 nm/I430 nm與TC (B)和OTC (D)濃度(0.00-50.00 μmol·L-1)之間的線性關(guān)系

5.3 熒光傳感器的選擇性

為了進(jìn)一步探究所構(gòu)建的熒光傳感器對(duì)TC和OTC的選擇性，選擇了離子(如Cu2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Na+、Cl-、)和天然氨基酸(如GSH、L-Glu、L-His、D-Try)作為干擾物進(jìn)行選擇性考察。如圖4A所示，NiNCs-Eu3+對(duì)TC和OTC的響應(yīng)值(I620nm/I430nm分別為7.4和10.7)遠(yuǎn)大于其他干擾物；且從圖4B看，在干擾物存在下，NiNCs-Eu3+對(duì)TC和OTC的響應(yīng)值基本無影響。結(jié)果表明構(gòu)建的比率熒光傳感器對(duì)TCs具有良好的選擇性。

圖4 (A) NiNCs-Eu3+與各種干擾物的I620 nm/I430 nm值；(B) 在干擾物存在下，NiNCs-Eu3+與TC的I620 nm/I430 nm值

5.4 樣品加標(biāo)回收率

分別在自來水和湖水中加入三個(gè)不同濃度的TC和OTC (5.00、10.00、20.00 μmol·L-1)，采用比率熒光傳感器進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，該方法在自來水和湖水的樣品加標(biāo)回收率分別90.20%-95.55%和89.10%-97.60%。

表1 自來水和湖水中TC和OTC的測(cè)定(n = 3)

為進(jìn)一步驗(yàn)證所制備比率熒光傳感器的性能，選用浸有NiNCs-Eu3+的試紙制作紙基傳感器檢測(cè)自來水和湖水中TC和OTC。向浸泡了NiNCs-Eu3+的試紙上分別加入0.00-50.00 μmol·L-1的TC和OTC，制作紙基熒光傳感器標(biāo)準(zhǔn)比色卡。如圖5A所示，隨著TC和OTC濃度增加，紙基比色卡的顏色逐漸從亮藍(lán)色變?yōu)榧t色，顏色遞變?nèi)庋劭杀孀R(shí)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證紙基熒光傳感器在實(shí)際樣品TCs檢測(cè)中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)將浸泡有NiNCs-Eu3+的試紙用于檢測(cè)自來水和湖水中的TC和OTC，并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。從圖5B可以看出，加標(biāo)水樣的試紙顏色與標(biāo)準(zhǔn)比色卡相接近，表明可通過紙基熒光傳感器可視化識(shí)別環(huán)境樣品中TCs。

圖5 (A) 紙基熒光傳感器可視化識(shí)別TC：標(biāo)準(zhǔn)比色卡(a)和識(shí)別自來水和湖水中的TC (b)；(B) 紙基熒光傳感器識(shí)別OTC：標(biāo)準(zhǔn)比色卡(a)和識(shí)別自來水和湖水中的OTC (b)

6 思考題

(1) 使用NiNCs作為熒光傳感器有哪些優(yōu)勢(shì)？

(2) 比率熒光傳感器的優(yōu)點(diǎn)？

(3) 什么是“天線效應(yīng)”和“內(nèi)部過濾效應(yīng)”？

(4) 紙基熒光傳感器用于熒光分析檢測(cè)有哪些優(yōu)點(diǎn)？

7 教學(xué)組織形式和實(shí)施成效

(1) 實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)安排和教學(xué)組織形式。

實(shí)驗(yàn)建議安排8學(xué)時(shí)，分為兩個(gè)階段進(jìn)行：第一階段為基于NiNCs-Eu3+的比率熒光傳感器檢測(cè)四環(huán)素和土霉素方法的建立和熒光機(jī)理的探索，以及選擇性和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)；第二階段為基于NiNCs-Eu3+的紙基熒光傳感器的制備和應(yīng)用。兩個(gè)階段共需約24 h (20 h + 4 h)。每組實(shí)驗(yàn)參與實(shí)驗(yàn)的學(xué)生人數(shù)為10-15人，每4個(gè)人1小組協(xié)作開展實(shí)驗(yàn)。

(2) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)可采用“線上線下”混合教學(xué)模式。

課前，學(xué)生通過綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)線上預(yù)習(xí)，自主觀看實(shí)驗(yàn)原理講授視頻、PPT、相關(guān)文獻(xiàn)等學(xué)習(xí)資料，了解實(shí)驗(yàn)的原理、步驟和注意事項(xiàng)，同時(shí)熟悉紫外-可見分光光度計(jì)和分子熒光光譜儀的原理、結(jié)構(gòu)和操作，完成預(yù)習(xí)報(bào)告。

線下課堂，教師可針對(duì)學(xué)生的預(yù)習(xí)情況進(jìn)行總結(jié)，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)，引導(dǎo)學(xué)生探究實(shí)驗(yàn)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，如：

① NiNCs的含量對(duì)NiNCs-Eu3+的熒光性能的影響；

② 反應(yīng)時(shí)間、溫度、酸度等因素對(duì)NiNCs-Eu3+熒光傳感器響應(yīng)性能的影響。

學(xué)生分組完成實(shí)驗(yàn)后，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)會(huì)數(shù)據(jù)處理、圖表繪制，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)撰寫科技論文。有條件的可要求學(xué)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行小組匯報(bào)。通過該項(xiàng)目可鍛煉學(xué)生化學(xué)專業(yè)綜合技能，培養(yǎng)學(xué)生查閱文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)技能、圖表繪制和科技論文撰寫的能力。

(3) 項(xiàng)目實(shí)施成效。

我校化學(xué)專業(yè)綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)基于科研創(chuàng)新平臺(tái)開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)，每年基于教師科研成果選取10個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目作為備選項(xiàng)目，學(xué)生根據(jù)自己的興趣選做其中4個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。該項(xiàng)目納入我校化學(xué)專業(yè)綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，并組織實(shí)施兩年。從近兩年選課的學(xué)生人數(shù)看，較多學(xué)生選擇該實(shí)驗(yàn)，并取得良好的教學(xué)效果。大部分學(xué)生認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)過程操作簡(jiǎn)便，能夠綜合鍛煉化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能，培養(yǎng)理論聯(lián)系實(shí)際的能力，同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理能力、圖表繪制能力也得到大大提升；另外，從這個(gè)可視化識(shí)別的實(shí)驗(yàn)中深刻理解了化學(xué)發(fā)光的原理和熒光傳感器的知識(shí)，激發(fā)了自己對(duì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究的興趣。2022年，學(xué)生用該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目組隊(duì)參加廣東省大學(xué)生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能大賽獲得了一等獎(jiǎng)。

8 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提出基于鎳納米團(tuán)簇-銪混合構(gòu)建紙基比率熒光傳感器可視化識(shí)別環(huán)境水體中四環(huán)素和土霉素的新方法。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，能綜合訓(xùn)練化學(xué)專業(yè)本科學(xué)生的專業(yè)技能，適合作為綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。該實(shí)驗(yàn)不僅讓學(xué)生理解熒光發(fā)光機(jī)理，還引入了天線效應(yīng)和內(nèi)部過濾效應(yīng)，讓學(xué)生通過查閱文獻(xiàn)拓展學(xué)習(xí)課外知識(shí)。同時(shí)，本項(xiàng)目提出比率熒光傳感器的方法可讓學(xué)生理解比率熒光傳感器相比于單信號(hào)熒光強(qiáng)度檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，讓學(xué)生懂得如何減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高解決實(shí)際問題的能力。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)H需使用紫外-可見分光光度計(jì)和分子熒光光譜儀等基礎(chǔ)性儀器分析設(shè)備，實(shí)驗(yàn)條件容易實(shí)現(xiàn)。總之，該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目具有靈活性、創(chuàng)新性和可視化等優(yōu)勢(shì)，不僅可以激發(fā)學(xué)生的研究興趣，也有利于學(xué)生綜合能力的培養(yǎng)。