銀葉金合歡葉多酚提取工藝優化及抗氧化性研究

黃秋萍，韋友歡，鄭燕菲，趙漢民，張云霞，黃秋嬋*

（廣西民族師范學院 化學與生物工程學院，廣西 崇左 532200）

銀葉金合歡（Acacia podalyriifolia）是薔薇目金合歡屬植物，又名珍珠相思、真珠相思、昆士蘭銀條等[1]，在我國主要分布于浙江、廣東、廣西、云南、四川等地[2]。銀葉金合歡的使用價值較高，本種多枝、多刺，可植作綠籬；木料堅固，可做為名貴工具；根及莢果含丹寧，可作為黑色著色汁，做藥服用能夠收斂清熱解毒；在冬天和早春有金黃色的球形狀的小花會盛開，花帶有清香，可以提煉香料；枝莖流出的樹脂，可以供美工用及藥用[3]。同時，銀葉金合歡具備四季長綠，葉子多、生長較快的特點，可以提供充足的實驗原材料。

目前，關于合歡屬植物的研究主要集中在化學成分和藥理活性方面的研究[4]，但銀葉金合歡植物有效化學成分的提取及提取液的藥理研究鮮見報道。植物多酚類化合物具有抑菌[5]、抗腫瘤[6-7]及抗氧化[8]等多種作用，且不同植物中多酚含量及活性存在一定差異[9-12]。植物多酚具體應用研究主要集中在植物多酚對畜禽肉品質調控作用[13-15]、調節糖脂代謝作用[16-17]、抗炎機制[18-20]等方面的研究。植物多酚目前常用的綠色提取方法主要是微波輔助提取和超聲波輔助提取，與傳統的提取方法對比，具有提取時間短、操作簡單、提取率高等特點[21-23]，但是由于實驗條件和成本的限制，并不能大規模實施，因此進一步開發高效、綠色、安全且能大規模實施的新型多酚提取方法是科學工作者們努力的重要方向。

為提高銀葉金合歡植物的綜合利用，本研究采用超聲波輔助提取法提取銀葉金合歡葉中的多酚，經單因素試驗和正交試驗確定最佳提取工藝條件，并探究銀葉金合歡葉多酚的抗氧化活性，以期為銀葉金合歡葉中有效成分的提取，為后期開發應用于天然食品抗氧化劑和天然多酚類藥物提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀葉金合歡葉：2021年12月采摘于廣西崇左市江州區廣西民族師范學院，洗凈，恒溫60 ℃烘干，粉碎（60目篩）備用。

石油醚、乙醇、鹽酸、抗壞血酸、丙酮、碳酸鈉、30%過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、甲醛、三氯化鐵、單寧酸（純度＞98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；福林酚（分析純）：上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

722型紫外可見光分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SB-120DT超聲清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；DF-101S磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；80-2離心沉淀器：金壇市醫療儀器廠；RE3000C旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；DGH-9143BS恒溫（鼓風）干燥箱：寧波楊輝儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 銀葉金合歡葉多酚的提取

原料的制備：稱取適量已粉碎并過60目篩的銀葉金合歡葉的粉末，放入圓底燒瓶中，按照固液比為1∶4（g∶mL）加入石油精，在70 ℃左右油浴鍋中回流4 h，對銀葉金合歡葉進行脫脂、脫色，趁熱減壓過濾去除濾液，放入50 ℃電烘箱中烘干，獲得脫脂脫色的銀葉金合歡葉粉。

多酚的提取：稱取銀葉金合歡葉粉末原料1.000 0 g，加入體積分數為70%丙酮溶液20 mL，在提取溫度為50 ℃，時間為20 min的情況下，進行超聲波輔助提?。ㄌ崛」β?0 W），離心（2 500 r/min、10 min）取上清液，即為銀葉金合歡葉多酚的提取液，注意避光保存。

1.3.2 銀葉金合歡葉多酚的檢測

采用福林酚試劑顯色法[24]，分別移取0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL質量濃度為0.137 mg/mL的單寧酸標準溶液于25 mL的容量瓶中，每個容量瓶中先后加入福林酚溶液1.3 mL、飽和碳酸鈉溶液5 mL，均搖勻靜置6 min，最后用蒸餾水定容至刻度線，得到質量濃度分別為0.004 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.010 mg/mL、0.012 mg/mL的單寧酸標準溶液，搖勻避光靜置30 min，測定波長760 nm處測相應濃度的吸光度值[25]。以單寧酸標準溶液的質量濃度（x）為橫坐標，以吸光度值（y）為縱坐標繪制單寧酸標準曲線，得到其標準曲線回歸方程為y=92.2x+0.183 8，相關系數R2=0.999 1。多酚得率的測定：根據標準曲線回歸方程，計算多酚的質量濃度，多酚得率的計算公式如下：

式中：W為銀葉金合歡葉多酚的得率，%；c為提取液質量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為提取液稀釋的倍數；m為脫脂原料的質量，g。

1.3.3 多酚提取條件優化的單因素試驗

準確稱取銀葉金合歡葉粉末原料1 g，加入體積分數70%丙酮溶液20 mL，料液比為1∶20（g∶mL），進行超聲波輔助提取，提取溫度為50 ℃，提取時間為20 min，經離心（2 500 r/min、10 min）后取上清液，分別考察提取溶劑（體積分數70%丙酮溶液、體積分數70%乙醇溶液、體積分數70%乙醇（1%鹽酸）溶液、蒸餾水）、丙酮體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、提取溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、提取時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）對銀葉金合歡葉多酚得率的影響。

1.3.4 多酚提取工藝條件優化的正交試驗

根據單因素試驗結果，以多酚得率為評價指標，以丙酮體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）為影響因素，進行L9（34）正交試驗設計，正交試驗因素與水平見表1。

表1 多酚提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for polyphenols extraction conditions optimization

1.3.5 抗氧化性能測定

測定最優條件下提取的銀葉金合歡葉多酚對DPPH·、·OH、NO·3種自由基的清除能力，以對應的清除率評價銀葉金合歡葉多酚的抗氧化活性。

DPPH·清除能力的測定：采用無水乙醇配制0.1 mg/mL的DPPH溶液，分別取質量濃度為0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL、0.35 mg/mL、0.4 mg/mL的銀葉金合歡葉多酚2 mL，再分別加入0.1 mg/mL的DPPH溶液2 mL，搖勻，避光放置30 min。用無水乙醇做為空白調零，在波長517 nm的條件下測定其吸光度值Ai。采用相同方法用無水乙醇替換DPPH溶液，記為Aj。取0.1 mg/mL的DPPH溶液2 mL和無水乙醇2 mL，反應30 min，測定吸光度值記為A0。以與樣品溶液濃度相同的抗壞血酸溶液作陽性對照[26]。試驗平行3次，取平均值。多酚對DPPH·的清除率的計算公式如下：

·OH清除能力的測定：分別于五支10 mL比色管中加入2.0 mL質量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的銀葉金合歡葉多酚溶液，然后依次加入濃度均為6 mmol/L的FeSO4和H2O2溶液各2.0 mL并搖勻，避光靜置15 min，然后加入2.0 mL的6 mmol/L水楊酸乙醇溶液且加水定容至刻度線搖勻，避光靜置30 min，在波長510 nm處測其吸光度值A1，不加水楊酸乙醇溶液的吸光度值記為A2，按照上述步驟，用蒸餾水取代樣品溶液作為空白對照，在波長510 nm處測其吸光度值記為A0，以與樣品溶液濃度相同的抗壞血酸作為陽性對照[27]。試驗平行測定3次取平均值，多酚對·OH的清除率計算公式如下：

NO·清除能力測定：分別移取質量濃度為0.25 mg/mL、0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、1.25 mg/mL的銀葉金合歡葉多酚溶液2 mL于10 mL比色管中，加入10 μg/mL的亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻避光條件下反應30 min，后加入4 g/L對氨基苯磺酸1.0 mL，搖勻避光靜置5 min，再加入2 g/L的鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，用去離子水定容至刻度線，搖勻避光靜置15 min，在波長540 nm處測其吸光度值Ai，其中沒有加亞硝酸鈉溶液的吸光度值記為Aj，按照相同的實驗步驟，用蒸餾水取代銀葉金合歡葉多酚溶液作為空白對照，在波長540 nm處測其吸光度值記為A0，同時以與樣品溶液濃度相同的抗壞血酸溶液對NO·的清除率作為陽性對照[28]。試驗平行測定3次取平均值，多酚對NO·的清除率計算公式如下：

1.3.6 數據處理

所有實驗數據平行測定3次取平均值，采用Origin8.5軟件進行數據處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 多酚提取條件優化單因素試驗結果

2.1.1 提取溶劑的確定

由圖1可知，不同的提取溶劑對銀葉金合歡葉多酚提取率不同，當以體積分數70%丙酮溶液作為提取溶劑時，得到的多酚提取率最高，為15.93%。其以相似相溶原理為依據，多酚物質和丙酮溶液的極性相似[29]，因此，確定銀葉金合歡葉多酚的提取溶劑為體積分數70%丙酮。

圖1 不同提取溶劑對銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of different extraction solvent on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.1.2 丙酮體積分數的確定

由圖2可知，隨著丙酮體積分數在50%～70%范圍內的增加，銀葉金合歡葉多酚的得率呈增加趨勢；當丙酮體積分數為70%時，銀葉金合歡葉多酚得率最高，為15.97%；丙酮體積分數＞70%，銀葉金合歡葉多酚得率逐漸降低，其原因可能是，提取劑的體積分數過大，脂溶性物質也逐漸增多[30]。因此，確定丙酮體積分數為70%。

圖2 丙酮體積分數對銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.2 Effect of acetone volume fraction on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.1.3 料液比的確定

由圖3可知，當料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（mg∶mL）時，多酚得率逐漸增加；當料液比為1∶20（g∶mL）時，多酚得率最高，為15.63%；料液比為1∶20、1∶25（g∶mL）時，多酚得率逐漸降低。其原因可能是，其他雜質隨著溶劑量增大而溶出增多[31]。因此，確定料液比為1∶20（g∶mL）。

圖3 料液比對銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.1.4 提取時間的確定由圖4可知，當提取時間為5～20 min時，銀葉金合歡葉

圖4 提取時間對銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

多酚得率呈增加趨勢；提取時間為20 min時；銀葉金合歡葉多酚得率達到最高值，為15.97%；當提取時間＞20 min時，多酚得率下降，其原因可能是，多酚被氧化分解導致多酚得率降低[32]。因此，確定提取時間為20 min。

2.1.5 提取溫度的確定

由圖5可知，當提取溫度為45～55 ℃時，多酚得率逐漸增加；當提取溫度55 ℃時，銀葉金合歡葉多酚得率最高，為16.35%，其原因可能是，滲透和擴散作用隨溫度升高而加快，多酚溶出增多而得率增大[33]；當提取溫度高于55 ℃時，多酚得率逐漸下降。因此，確定提取時間為55 ℃。

圖5 提取溫度對銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.2 提取條件優化正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以多酚得率為評價指標，以丙酮體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）為影響因素，進行L9（34）正交試驗設計，多酚提取條件優化正交試驗結果與分析見表4。

表4 多酚提取條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiment for polyphenols extraction conditions optimization

由表4可知，影響銀葉金合歡葉多酚得率的4個因素的強弱順序為B＞D＞C＞A，即料液比＞提取時間＞提取溫度＞丙酮體積分數。正交試驗得到銀葉金合歡葉多酚提取工藝的最佳組合A2B3C2D2。即丙酮體積分數70%、料液比1∶25（g∶mL）、提取溫度為55 ℃和提取時間20 min。在此最佳提取工藝條件進行3次平行驗證試驗，獲得多酚得率為17.65%。

2.3 銀葉金合歡葉多酚的抗氧化活性測定結果

2.3.1 銀葉金合歡葉多酚對DPPH·的清除能力

由圖6可知，當銀葉金合歡葉多酚和抗壞血酸（vitamin C，VC）溶液質量濃度為0.2～0.4 mg/mL時，對DPPH·的清除率逐漸增加，當質量濃度為0.4 mg/mL時，多酚溶液對DPPH·的清除率達到最高值，為91.06%，VC溶液對DPPH·的清除率為95.28%。結果表明，銀葉金合歡葉多酚對DPPH·具有一定清除能力。

圖6 銀葉金合歡葉多酚對DPPH·的清除能力Fig.6 Effect of polyphenols from Acacia podalyriifolia leaves on the scavenging capacity of DPPH·

2.3.2 銀葉金合歡葉多酚對·OH的清除能力

由圖7可知，當VC溶液的質量濃度為0.5～1.5 mg/mL時，對·OH的清除能力上升最快；當VC溶液的質量濃度＞1.5 mg/mL時，對·OH的清除能力的變化趨勢趨于平穩；當銀葉金合歡葉多酚質量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，其對·OH的清除率逐漸上升，當多酚質量濃度為2.5 mg/mL時，其對·OH的清除率達到最高值，為89.27%。表明銀葉金合歡葉多酚對·OH具有一定的清除能力。

圖7 銀葉金合歡葉多酚對·OH的清除能力Fig.7 Effect of polyphenols from Acacia podalyriifolia leaves on the scavenging capacity of·OH

2.3.3 銀葉金合歡葉多酚對NO·的清除能力

由圖8可知，隨著兩種溶液的質量濃度在0.25～1.25 mg/mL的范圍內增加，其對NO·清除能力逐漸增加；當兩種溶液質量濃度為1.25 mg/mL時，其對NO·的清除能力均達到最大值，銀葉金合歡葉多酚對NO·的清除率達57.51%，VC溶液對NO·的清除率達73.33%。結果表明，銀葉金合歡葉多酚對NO·具有一定的清除能力。

圖8 銀葉金合歡葉多酚對NO·的清除能力Fig.8 Effect of polyphenols from Acacia podalyriifolia leaves on the scavenging capacity of NO·

3 結論

本研究采用超聲輔助提取法確定銀葉金合歡葉多酚的最佳提取工藝條件為丙酮體積分數70%、料液比1∶25（g∶mL）、提取溫度55 ℃、提取時間20 min。在此優化條件下，銀葉金合歡葉多酚得率為17.65%。銀葉金合歡葉多酚具有較好的抗氧化性，其對DPPH·、·OH及NO·的清除率分別為91.06%、89.27%和57.51%，清除效果較好。因此，銀葉金合歡葉在抗氧化功能食品和藥品研發方面具備很好應用價值。后續會對銀葉金合歡葉的其他活性成分進行提取以及對多酚成分進行分離鑒定，探究各有效成分與抗氧化活性的關系，為后續銀葉金合歡多酚作為天然食品及藥品添加劑的具體應用提供基礎和依據。