產4-乙基愈創木酚菌株的篩選、鑒定及其在醬油釀造中的應用

張穎超，于 鑫，趙祥穎，*，劉麗萍，黃艷紅，張家祥，劉建軍

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省食品發酵工業研究設計院，山東 濟南 250013；2.齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；3.山東玉兔食品股份有限公司，山東 淄博 255300）

醬油是一種傳統調味品，在中國、韓國和日本廣受歡迎[1]。目前，高鹽稀態發酵工藝仍是我國醬油釀造的主要方法，其主要的工藝特征是在較高鹽濃度（20%）下進行控溫或非控溫發酵2～6個月[2]。醬油發酵機理是一個錯綜復雜的生物化學反應過程，發酵過程中環境中的微生物，如芽孢桿菌（Bacillus）、酵母菌和乳酸菌等，會產生許多特征性風味化合物[3]。

目前，從醬油中發現的特征性風味化合物主要有4-乙基愈創木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）、4-乙烯基愈創木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮、苯乙醛、3-甲硫基丙醇、吡嗪類化合物等[4-6]。其中，4-EG是一種揮發性酚類化合物，呈發酵香氣，具有煙熏味、丁香味和辛香味，屬醬香型香氣，其作為醬油關鍵風味成分，具有緩和咸味作用[7-8]。此外，4-EG可以對抗人體異常氧化應激，具有保護細胞和抑制炎癥免疫反應的作用[9-10]。4-EG風味閾值極低，0.5 mg/L的質量濃度就能被感官識別，1～2 mg/L的質量濃度便可明顯改善醬油的風味品質[11]。目前，報道能夠產4-EG的微生物菌株比較少，大部分菌株是以4-VG為前體合成4-EG，然而能直接利用阿魏酸（ferulic acid，FA）合成4-EG的微生物卻鮮有報道[12-13]。

本研究采用傳統培養分離方法結合耐鹽性及4-EG生產能力測定，從廣式高鹽稀態醬油發酵醬醪中分離篩選能代謝FA合成4-EG的微生物，通過形態觀察、分子生物學技術對分離菌株進行鑒定，同時對其生長特性進行研究，并將其應用于醬油生產，為改善提升醬油品質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株豆粕、炒麥、麥麩、米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042的孢子粉、生醬油、醬醪：山東玉兔食品股份有限公司。

1.1.2 試劑

食鹽（未加碘）：濟南家家悅購物超市；大豆蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸出物（生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖（分析純）：山東西王糖業有限公司；FA、4-乙烯基愈創木酚（4-VG）、4-乙基愈創木酚（4-EG）（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS肉湯：北京奧博星生物技術有限責任公司。

麥芽汁培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

分離培養基[14]：30%生醬油，20%麥芽汁，15%MRS肉湯，2%瓊脂，10%氯化鈉，0.01%氯霉素，pH為7.1。

LB液體培養基[15]：1%大豆蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母浸粉。固體培養基中添加2%瓊脂。

篩選培養基：LB液體培養基中添加0.01%FA。

高鹽LB培養基：LB固體培養基中添加10%氯化鈉。

以上培養基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

7200分光光度計：上海尤尼科儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東科學院生物研究所；PB-10 pH計：德國賽多利斯集團；Diane Utimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、U3000紫外檢測器、ProFlexTM96孔聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技有限公司；FlavourSpecR風味分析儀：山東海能科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

在無菌條件下將醬醪用10%的鹽水稀釋1倍制成懸浮液，再用10%的鹽水進行梯度稀釋后涂布于分離培養基平板，37 ℃培養24～48 h。挑取單菌落接種于高鹽LB培養基，37 ℃培養24～48 h，經多次分離純化得到單菌落。

1.3.2 高產4-乙基愈創木酚菌株的篩選

將分離純化的菌株接種于篩選培養基中，在37 ℃、150 r/min條件下搖瓶培養72 h，測定發酵液中的4-EG含量，篩選4-EG產量高的菌株。

1.3.3 篩選菌株的鑒定

形態觀察：挑取篩選菌株的單菌落接種于LB固體培養基，37 ℃培養24～48 h，觀察記錄培養基上菌落的質地和形態等特征，用接種環挑取典型菌落進行鏡檢，觀察菌體形態。

分子生物學鑒定：將純化的單菌落接種到LB液體培養基，37 ℃培養24 h，離心棄去上清液，采用0.9%生理鹽水洗滌菌體，將菌體送到青島生物工程有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basiclocalalignmentsearch tool，BLAST）序列同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 11.0中的鄰接（neigh bor-joining，NJ）法構建系統發育樹，并進行1 000次bootstraps檢驗計算支持率。

1.3.4 篩選菌株生長性能測試

培養溫度的影響：將純化的單菌落接種到LB液體培養基，37 ℃培養24 h制備種子液，按照5%（V/V）的接種量將種子液接種到LB液體培養基中，在不同的培養溫度（37 ℃、45 ℃、52 ℃）條件下靜置培養24 h，測定培養液菌體濃度（OD600nm值），根據菌體濃度確定菌株的最佳生長溫度。

轉速的影響：按照5%（V/V）的接種量將種子液接種到LB液體培養基中，在最佳生長溫度條件下，在不同轉速（0、40 r/min、80 r/min、120 r/min、160 r/min）條件下培養24 h，測定培養液菌體濃度（OD600nm值），確定最佳轉速。

鹽含量的影響：按照5%（V/V）的接種量將種子液接種到不同鹽含量（0、5%、10%、15%、20%）的LB液體培養基中，在最適條件下培養24 h，測定培養液菌體濃度（OD600nm值），考查菌株的耐鹽性。

1.3.5 高鹽含量下篩選菌株轉化FA進程

將種子液按5%（V/V）的接種量接種至鹽含量為20%的LB液體培養基中，其中添加初始質量濃度為100 mg/L的FA。在45 ℃、160 r/min條件下培養，分別在培養5 d、10 d、15 d時取樣，測定發酵液中的FA、4-VG、4-EG含量。

1.3.6 篩選菌株在醬油發酵中的應用

采用高鹽稀態法釀造醬油[16]。將純化的單菌落接種到鹽含量為5%的LB液體培養基中，45 ℃、160 r/min條件下培養，待菌液濃度達2×108CFU/mL時，停止培養。實驗組按5%（V/V）的接種量接種產4-EG菌株，對照組加入5%（V/V）的LB液體培養基，45 ℃發酵。發酵前5 d，每天攪拌一次，之后間隔5 d攪拌一次，取發酵0、5 d、10 d、15 d、30 d、60 d的樣品，測定醬油發酵液中FA、4-EG、氨基酸、有機酸和葡萄糖含量，選取發酵15 d和30 d的樣品測定揮發性風味物質，并對發酵結束的醬油進行感官品評。

1.3.7 測定方法

菌體濃度的測定：將菌體培養液適當稀釋，采用UNICO 7200分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值。FA、4-VG、4-EG含量的測定：按照文獻[17]的HPLC法。氨基酸含量的測定：按照文獻[18]的HPLC法。有機酸和葡萄糖含量的測定：按照文獻[19]的HPLC法。揮發性風味物質的測定：按照文獻[20-21]的氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographyion mobility spectrometry，GC-IMS）法。感官評價：選取7位受到系統培訓的品評員按照文獻[22-23]對滅菌的醬油發酵液的滋味和香氣進行盲評。

1.3.8 數據處理

每個實驗均設置3次平行，實驗數據使用Origin2019和SPSS 26處理，實驗結果用“平均值±標準差”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 高產4-EG菌株的分離篩選

將醬醪樣品進行多次稀釋涂布培養和劃線分離，根據菌落特征初步分離篩選獲得6株耐高鹽的菌株，編號為XJB-1、XJB-2、XJB-3、JLB30-1、JLB30-2、JLB30-3。6株菌株發酵液中的4-EG含量見表1。由表1可知，菌株JLB30-1、JLB30-2、JLB30-3可利用篩選培養基中的FA產生4-EG，且菌株JLB30-2產4-EG的能力最強，4-EG含量可達15.67mg/L。

表1 初篩菌株的4-EG產量測定結果Table 1 Determination result of 4-EG yield of the initial screening strain

2.2 菌株JLB30-2的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株JLB30-2在LB固體培養基上的菌落形態及細胞形態見圖1。

圖1 菌株JLB30-2的菌落形態（a）與細胞形態（b）Fig.1 Colony morphology (a) and cell morphology (b) of strain JLB30-2

由圖1可知，菌株JLB30-2的菌落白色不透明，形狀不規則，中央隆起，表面粗糙有皺褶，邊緣不規則，濕潤粘稠且易挑起；在顯微鏡下菌體呈長桿狀。

2.2.2 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構建菌株JLB30-2的系統進化樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株JLB30-2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于同一分支，綜合該菌株的形態特征，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株JLB30-2的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain JLB30-2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 枯草芽孢桿菌JLB30-2的生長特性

2.3.1 培養溫度對枯草芽孢桿菌JLB30-2生長的影響

枯草芽孢桿菌JLB30-2在不同培養溫度條件下的生長情況見圖3。由圖3可知，B.subtilisJLB30-2在37～52 ℃條件下均能生長，且在45 ℃條件下OD600nm值最高。說明該菌株最佳生長溫度為45 ℃，適合高溫發酵。目前，醬油發酵工藝主要有兩大類：以高鹽稀態和低鹽固態發酵工藝為代表的高溫發酵工藝，發酵的溫度在45 ℃左右；以日式醬油為代表的常溫發酵，發酵溫度在30 ℃左右[24-25]。B.subtilisJLB30-2的生長溫度與高溫發酵工藝相適應，因此，可以作為產香菌株添加到醬油中發揮作用。

圖3 培養溫度對菌株JLB30-2生長的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the growth of strain JLB30-2

2.3.2 轉速對菌株JLB30-2生長的影響

菌株JLB30-2在不同轉速條件下的生長情況見圖4。由圖4可知，菌體OD600nm值隨搖床轉速的升高呈上升趨勢，在低氧條件下，B.subtilisJLB30-2仍能較好生長，并且隨著發酵時間的延長，發酵液菌體OD600nm值逐漸變大，靜置培養6 d時，發酵液的菌體OD600nm值可達12.93。表明B.subtilisJLB30-2能在溶氧較少的醬醪中生長，為其作為產香菌株添加到醬油中應用提供了可能。

圖4 轉速對菌株JLB30-2生長的影響Fig.4 Effect of rotational speed on the growth of strain JLB30-2

2.3.3 鹽含量對枯草芽孢桿菌JLB30-2生長的影響

醬油釀造所需的高鹽濃度影響微生物的生長和繁殖，能在這種環境下生存的微生物必須具有一定的耐鹽特性。因此，對枯草芽孢桿菌JLB30-2的耐鹽性進行分析，結果見圖5。由圖5可知，在相同培養條件下，隨著鹽含量的增加，B.subtilisJLB30-2的生長受到抑制，但隨著培養時間的延長，OD600nm值仍呈緩慢增加態勢，在20%的高鹽含量下B.subtilisJLB30-2仍能緩慢生長。由此可知，B.subtilisJLB30-2能耐受醬油的高鹽環境。

圖5 鹽含量對菌株JLB30-2生長的影響Fig.5 Effect of salt concentration on the growth of strain JLB30-2

2.4 高鹽環境對枯草芽孢桿菌JLB30-2轉化FA的影響

高鹽環境（20%鹽含量）對枯草芽孢桿菌JLB30-2轉化FA生產4-VG和4-EG的影響見圖6。由圖6可知，在20%鹽含量條件下，隨著發酵時間的延長，FA含量逐漸下降，4-VG和4-EG含量逐漸升高，發酵15 d后發酵液中FA含量降至47.00 mg/L，4-VG含量及4-EG含量均達到最高，分別為34.20 mg/L、21.00 mg/L。在整個發酵過程中FA的利用量與4-EG的生成量呈負相關。由此可知，B.subtilisJLB30-2可以適應高鹽條件，具有優越的代謝功能，在高鹽環境下發酵可以產生大量的4-EG，使得發酵液香氣濃郁，適合增強醬油的風味，因此，選擇B.subtilisJLB30-2作為產香菌株添加到醬油中。

圖6 高鹽環境對菌株JLB30-2轉化阿魏酸的影響Fig.6 Effect of high salt environment on converting ferulic acid of strain JLB30-2

2.5 枯草芽孢桿菌JLB30-2在醬油發酵中的應用

2.5.1 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油中4-EG含量的影響醬油中的阿魏酸主要存在于谷物原料（大豆、小麥和麩皮）的細胞壁中，其單體以及二聚體主要以酯鍵結合到阿拉伯糖殘基上或醚鍵結合到木質素表面[26]。在醬油發酵過程中，細胞壁中的FA需要被微生物產生的阿魏酸酯酶水解才能釋放[27]。醬油發酵過程中，FA及4-EG含量的變化見圖7。由圖7可知，隨著發酵時間的延長，對照組和實驗組FA的含量逐漸降低，4-EG含量逐漸升高。發酵60 d時，實驗組FA含量降到17.5 mg/L，4-EG產量達到29.75 mg/L，而未強化枯草芽孢桿菌JLB30-2的對照組FA含量為55.5 mg/L，4-EG含量為6.85 mg/L，所以在醬醪中強化B.subtilisJLB30-2能明顯提高FA到4-EG轉化效率，提高醬油中的4-EG含量。

圖7 菌株JLB30-2對醬油發酵中生成4-EG的影響Fig.7 Effect of strain JLB30-2 on 4-EG production in soy sauce fermentation

2.5.2 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油中揮發性風味物質的影響

采用GC-IMS分析強化枯草芽孢桿菌JLB30-2實驗組和對照組醬油發酵15 d和30 d的揮發性風味物質組成，指紋圖譜見圖8。由圖8可知，隨著發酵時間延長，揮發性風味物質的組成變化比較明顯，且實驗組和對照組之間也有差異。發酵15 d時，對照組中含量多的揮發性風味物質主要是醛類，如糠醛、苯甲醛、苯乙醛等，呈杏仁味香氣[28]，實驗組中含量多的揮發性風味物質主要是酮類，如3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、1-辛烯-3-酮等，呈花果香和奶油香氣[29]。發酵30 d時，對照組中苯乙醛、己醛、壬醛等物質含量比發酵15 d的變多，實驗組中2-己酮、2-丁酮、3-辛酮等物質含量比發酵15 d的變多。由圖8亦可知，對照組和實驗組中含量多的揮發性風味物質以醛類和酮類物質為主，隨著發酵時間的增加，醛類物質含量逐漸減少，而酮類物質含量不斷增加，其中實驗組中的酮類物質含量高于對照組的酮類物質含量，說明菌株JLB30-2能夠促進醬油中酮類物質的產生，有助于醬香風味的形成。

圖8 菌株JLB30-2對醬油揮發性風味物質的影響Fig.8 Effect of strain JLB30-2 on the volatile flavor substances in soy sauce

2.5.3 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油中氨基酸、有機酸及葡萄糖的影響

醬油發酵過程中游離氨基酸、有機酸及葡萄糖含量的變化見圖9。游離氨基酸是醬油鮮味的主要來源，另外，氨基酸可以通過酶催化和非酶催化生成各類呈香物質，豐富醬油的香氣[30-31]。由圖9a可知，隨著發酵時間的延長，醪液中氨基酸含量也逐步增加，前期增速較快，后期增速變慢，這主要是蛋白酶的作用。值得注意的是，強化枯草芽孢桿菌JLB30-2實驗組的氨基酸含量明顯高于對照組，這可能與枯草芽孢桿菌JLB30-2可以分泌少量蛋白酶有關。

圖9 菌株JLB30-2對醬油發酵過程中氨基酸（a）、有機酸（b）及葡萄糖（c）含量的影響Fig.9 Effect of strain JLB30-2 on the contents of amino acids (a), organic acids (b), and glucose (c) in soy sauce fermentation process

有機酸和葡萄糖對醬油的風味形成也發揮重要作用[32]，由圖9b可知，在醬油發酵過程中，實驗組和對照組的有機酸組成相似，主要為乳酸、草酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸，含量也沒有明顯的區別，說明枯草芽孢桿菌JLB30-2對有機酸的合成影響較小。由圖9c可知，醬油發酵過程中葡萄糖含量始終處于較低水平，實驗組發酵初期葡萄糖有快速下降階段，說明枯草芽孢桿菌JLB30-2在醪液中有較高的活性，增加了糖消耗。

2.5.4 強化枯草芽孢桿菌JLB30-2對醬油感官品質的影響

對兩組醬油的滋味和香氣特征進行感官評分，結果見圖10。由圖10可知，在滋味方面，實驗組的鮮味、煙熏味、厚味、甜味、酸味、綜合口感和偏愛程度均高于對照組；在香氣方面，實驗組的花果香、焦香、醇香、醬香、麥芽香、大豆香、綜合香氣和偏愛程度均高于對照組，說明強化B.subtilisJLB30-2后可以提升成品醬油的感官品質，這與文獻[33]報道添加B.subtilis或其他產香細菌可以改善醬油的感官品質的研究結果相似，說明B.subtilisJLB30-2在改善醬油風味和感官方面有較好的應用前景。

圖10 菌株JLB30-2對醬油滋味（a）和香氣（b）的影響Fig.10 Effect of strain JLB30-2 on taste(a)and aroma(b)of soy sauce

3 結論

本研究從廣式高鹽稀態醬油的醬醪中分離篩選到1株能夠將FA高效轉化為4-EG的細菌JLB30-2，經形態觀察及分子生物學技術鑒定其為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株在45 ℃、160 r/min、20%鹽含量環境下，能將發酵液中的FA轉化為4-EG，說明其能夠很好地適應廣式高鹽稀態醬油釀造過程中高鹽、高溫、低氧環境。在醬油釀造過程強化菌株JLB30-2，發酵60 d時，醬油中4-EG含量為29.75 mg/L，是對照組（6.85 mg/L）的3.34倍，同時增加了醬油中氨基酸、酮類化合物的含量，強化了醬油醇香和醬香，提高了醬油的感官品質，對提升醬油品質具有重要實用價值。