基于高通量測序分析不同地區魔芋根際土壤細菌群落多樣性

雷 高，李珊珊，李亮亮，王佰濤，楊文玲，劉德海*

（1.河南省科學院生物研究所，河南 鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450008）

魔芋（Amorphophallus konjac）為天南星科（Araceae）魔芋屬（AmorphophallusB1.ex Decne.）多年生草本植物的塊莖，是目前自然界唯一能大量提供葡甘聚糖的重要經濟作物[1]。葡甘聚糖是一種高分子優質膳食纖維，具有凝膠性、增稠性、持水性和成膜性等獨特的性質，被廣泛應用于生物醫學、食品和化工等領域[2-3]。雖然葡甘聚糖得到了廣泛的應用，但由于其相對分子質量較大、黏度大，因此在食品工業的應用上受到了限制[4]。因此將魔芋中的大分子降解為小分子，即魔芋低聚糖，不僅可以大大降低其黏度，還可以提高其在食品中的應用范圍[5]。據報道，魔芋低聚糖具有促進有益微生物特別是耐氧雙歧桿菌生長[6-7]、提高機體抗氧化能力[8]、降血脂及護肝作用[9-10]、排毒與增強免疫功能的作用[11]。

魔芋低聚糖是一系列葡甘露低聚糖的混合物，是由β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露糖苷鍵得到的產物[12]。β-甘露聚糖酶的活性決定了魔芋低聚糖的水解程度[13]。目前，β-甘露聚糖酶主要來源于微生物[14-15]，細菌來源的常見于芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）及產酸細菌等[16-18]。雖然β-甘露聚糖酶來源廣泛、數量眾多，但由于飼料固體發酵中發酵溫度不易控制和底物復雜性的影響，β-甘露聚糖酶的應用受到了限制[19-20]。因此，獲得底物利用廣泛，溫度適應區間大，活性高的β-甘露聚糖酶是解決飼料發酵中的重點[21-22]。本實驗擬以昆明、寧德和南陽的多年種植魔芋區域的根際土壤為研究對象，通過Illumina MiSeq高通量測序技術對3地區魔芋根際土壤中細菌種類和群落結構多樣性進行分析，旨在獲得魔芋根際土壤中更加準確、全面的細菌多樣性信息，為后續β-甘露聚糖酶的篩選及開發利用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

魔芋根際土壤：分別采自云南昆明、福建寧德、河南南陽。

1.1.2 化學試劑

E.Z.N.A.RSoil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit：美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖：西班牙Biowest公司；FastPfu 聚合酶：北京全式金生物技術（TransGen Biotech）有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：美國Axygen公司；NEXTFLEXRRapid DNA-Seq Kit：美國Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3：美國llumina公司。

1.2 儀器與設備

N13462C移液器、5430R小型離心機、5424R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；BioTek ELx800酶標儀：美國Biotek公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光計：美國Promega公司；ABI GeneAmpR9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

試驗樣品采自云南昆明、福建寧德、河南南陽的魔芋根際土壤，分別編號為ND（種植時間3年，海拔1 992 m，東經118°88′，北緯27°08′）、KM（種植時間1年，海拔996 m，東經103°47′、北緯25°40′）、NY（種植時間半年，海拔949 m，東經111°15′，北緯33°38′）。采用隨機取樣法，在魔芋種植區域隨機選取3個樣方（1 m×1 m），每個樣方中隨機選取3個魔芋植株。取樣時鏟去表層土壤（0～5 cm），取5～20 cm附著于魔芋根際及塊莖上的土壤裝入無菌自封袋后充分混勻，將3個取樣點采集的土壤混合為一個樣品。每個取樣地點采集樣品3個，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 樣品總DNA提取和PCR擴增及高通量測序

采用磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA，使用NanoDrop ND-2000分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行PCR擴增和高通量測序。選擇細菌16S rRNA通用引物338F和806R對細菌16S rRNA序列的V3～V4可變區進行擴增。引物序列為338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR擴增體系：4 μL 5×FastPfu Buffer，0.4 μL FastPfu聚合酶，0.2 μL 牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），上下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，2 μL 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）（2.5 mmol/L），1 μL DNA模板（10 ng/μL），雙蒸水（ddH2O）補至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s，30個循環；72 ℃、10 min；4 ℃保存。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠檢測合格，純化后構建PE文庫，使用Illumina公司的Miseq臺式測序儀進行高通量測序。

1.3.3 高通量測序數據處理與分析

原始測序序列使用Trimmomatic軟件進行質控后，采用Flash軟件進行拼接。過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads，根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列。結合序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，調整序列的方向，得到有效序列。使用Uchime軟件對拼接好的序列剔除嵌合體，采用Uparse軟件按照97%的相似度對有效序列聚成不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。通過Mothur和Qiime軟件計算不同地區魔芋根際土壤中細菌基于OTU分類水平的生物多樣性指數，主要包括Ace指數、Chao1指數、Shannon指數以及Simpson指數，用以探索不同地區魔芋根際土壤樣本間細菌群落組成的相似性和差異性。

1.3.4 魔芋根際土壤理化性質的測定

魔芋根際土壤pH、有機質、速效磷、速效鉀、堿解氮：參照《土壤農化分析》中的方法測定[23]。

1.3.5 數據處理

實驗數據的處理采用Excel 2016，顯著性差異分析采用SPSS 20.0。

2 結果與分析

2.1 不同地區魔芋根際土壤理化性質分析

昆明（KM）、寧德（ND）和南陽（NY）魔芋根際土壤樣品的pH、有機質、速效磷、速效鉀和堿解氮含量測定結果見表1。

表1 不同地區魔芋根際土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of konjac rhizosphere soil samples from different regions

由表1可知，寧德（ND）魔芋根際土壤的pH、有機質、速效磷和速效鉀顯著高于昆明（KM）和南陽（NY）（P＜0.05）；堿解氮指標寧德（ND）與昆明（KM）、南陽（NY）差異顯著（P＜0.05），南陽（NY）與昆明（KM）差異不顯著（P＞0.05）。表明不同地區魔芋根際土壤的理化性質存在明顯的差異。

2.2 不同地區魔芋根際土壤細菌群落結構和多樣性分析

基于OTU分類水平，對3處魔芋根際土壤樣品進行多樣性指數分析。通過對KM、ND、NY 3處魔芋根際土壤樣品中細菌進行高通量測序，結果見表2。

表2 不同地區魔芋根際土壤樣品中細菌菌群多樣性分析結果Table 2 Analysis results of bacterial community diversity of konjac rhizosphere soil samples from different regions

由表2可知，KM、ND、NY樣品得到有效序列數分別為123 365、129 763、130 598。在97%相似度水平下劃分OTU，3處樣品共得到8 156個OTU。Chao1指數和Ace指數常用來表述群落豐富度，其數值越大表明群落物種豐富度越高。Shannon指數和Simpson指數用來表述群落多樣性，Shannon指數越大，Simpson指數越小，表明群落物種的多樣性越高。由表2可知，ND樣品的Chao1指數（1292.35）、Ace指數（1296.47）均顯著高于KM和NY（P＜0.05），說明其土壤中細菌群落物種豐富度最高；ND樣品的Shannon指數（5.89）顯著高于KM和NY（P＜0.05），Simpson指數（0.006 7）顯著低于KM（P＜0.05），表明其土壤中細菌群落多樣性最高。

選取OTU序列，繪制Venn圖見圖1。

圖1 不同地區魔芋根際土壤樣品中細菌OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacterial OTU of konjac rhizosphere soil samples from different regions

由圖1可知，KM、ND、NY 3處地點的土壤樣品共有的OTU數量為1355個，特有的OTU數量分別為442、692、447個，其余OTU為不同地區間共有。3處地點的土壤樣品測序的覆蓋率均＞99%，表明試驗的取樣合理，測序數據較好，能真實反映樣本的實際情況，可進行后續數據分析。

基于土壤樣品中細菌的OTU得到Sobs稀釋曲線見圖2。由圖2可知，隨著抽樣數的增加，3處地點的土壤樣品9個土壤樣品的Sobs指數沒有趨于平緩，表明繼續加大測序量可能會發現更多OTU。

圖2 不同地區魔芋根際土壤樣品Sobs稀釋曲線Fig.2 Sobs rarefaction curves of konjac rhizosphere soil samples from different regions

Shannon-Wiener曲線是反映樣品中微生物多樣性的指數，利用各樣品的測序量在不同深度時的微生物多樣性指數構建曲線，以此反映各樣品在不同測序數量時的微生物多樣性。當曲線趨向平緩時，說明測序數據量足夠大，可以準確反映樣品中絕大多數的微生物信息。以KM、ND和NY 3處地點的9個土壤樣品的香農指數和序列數繪制Shannon-Wiener曲線見圖3。由圖3可知，隨著測序序列數的增加，3處地點的9個土壤樣品的香農指數趨于平緩，表明測序數據量足夠大，可以準確反映樣品中微生物群落的多樣性。

圖3 不同地區魔芋根際土壤樣品Shannon-Wiener曲線Fig.3 Shannon-Wiener curves of konjac rhizosphere soil samples from different regions

2.3 屬水平上不同地區魔芋根際土壤細菌的種類和相對豐度分析

在屬水平上，基于高通量測序技術對不同地區的魔芋根際土壤中細菌的種類和相對豐度進行分析。根據相對豐度將樣本中的菌屬分為優勢菌屬（相對豐度≥1.0%）和次要菌屬（相對豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），結果見圖4。

圖4 基于屬水平KM（a）、ND（b）及NY（c）魔芋根際土壤樣品中細菌種類及相對豐度Fig.4 Species and relative abundance of bacteria in KM (a), ND (b) and NY(c)konjac rhizosphere soil samples based on genus level

由圖4a可知，KM樣本中優勢菌屬有12個，其中節桿菌屬（Arthrobacter）相對豐度最高，為4.06%；其次為大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium），相對豐度為3.64%；其余依次為鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（3.20%）、黃色桿菌屬（Xanthobacter）（2.12%）、放線菌屬（Gaiellales）（1.82%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.79%）、Vicinamibacterales（1.52%）、芽球菌屬（Blastococcus）（1.39%）、熱酸菌屬（Acidothermus）（1.15%）、地桿菌屬（Terrabacter）（1.15%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（1.03%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）（1.01%）。

由圖4b可知，ND樣本中優勢菌屬有7個，節桿菌屬（Arthrobacter）相對豐度最高，為3.49%；其余依次為Vicinamibacterales（2.12%）、放線菌屬（Gaiellales）（1.72%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（1.71%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（1.31%）、微桿菌屬（Microbacterium）（1.14%）、地桿菌屬（Terrabacter）（1.07%）。

由圖4c可知，NY樣本中優勢菌屬有7個，其中節桿菌屬（Arthrobacter）相對豐度最高，為4.59%；其余依次為Vicinamibacterales（4.01%）、大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（2.53%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.40%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（1.38%）、黃色桿菌屬（Xanthobacter）（1.37%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（1.02%）。

對比昆明（KM）、寧德（ND）、南陽（NY）3個地區魔芋根際土壤細菌優勢菌屬的種類，發現不同地區之間存在種類上的差異。節桿菌屬（Arthrobacter）、Vicinamibacterales、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）為3個地區所共有，熱酸菌屬（Acidothermus）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）為昆明樣品獨有；微桿菌屬（Microbacterium）為寧德樣品特有；芽孢桿菌屬（Bacillus）則只在南陽樣品中發現。表明不同地區魔芋根際土壤細菌優勢菌屬種類存在差異，這與彭玉嬌等[24]的研究結果一致。

3 結論

本研究運用Illumina MiSeq高通量測序技術對昆明、寧德和南陽魔芋根際土壤中細菌的群落結構和多樣性進分析比較，結果表明，昆明、寧德和南陽地區魔芋根際土壤的細菌豐富度和物種多樣性存在顯著性差異（P＜0.05），其中昆明樣品中優勢菌屬有12個，熱酸菌屬（Acidothermus）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）為獨有；寧德樣品中優勢菌屬有7個，微桿菌屬（Microbacterium）為其特有；南陽樣品中優勢菌屬有8個，芽孢桿菌屬（Bacillus）為其獨有。