多菌混合發酵豆豉后發酵工藝優化及品質分析

牛 剛，朱仁萍，陳中愛，3，魏美娟，朱仁俊，胡永金，薛橋麗*

（1.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省昭通市食品藥品檢驗所，云南 昭通 657000；3.貴州省農業科學院 食品加工研究所，貴州 貴陽 550006；4.云南農業大學學報 編輯部，云南 昆明 650201）

豆豉是以黃豆或黑豆為原料，經各種微生物的發酵形成的具有特殊色、香、味的傳統調味副食品，因其獨特的香氣和味道以及其兼具功能性和營養性而深受消費者喜愛[1]。根據發酵時主導微生物的不同可分為曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、細菌型豆豉和根霉型豆豉四大類[2]。

傳統的發酵豆豉主要是利用天然存在于生大豆或空氣中的微生物制作的，如霉菌、酵母和細菌。廣泛的微生物參與發酵，有助于在豆豉發酵過程中形成代謝物。自然發酵或是采用半開放式制曲發酵受外界環境因素影響較大，易受雜菌污染，使豆豉品質難以控制，并且存在發酵周期長、產業化生產程度底等問題[3]。在豆豉發酵過程中微生物群落是豆豉品質形成的關鍵。研究表明，控制發酵過程中的優勢菌種可以明顯縮短周期，提高品質[4-5]。目前，人工可控共存微生物發酵已被認為是實現工業化生產高質量、標準化豆豉產品的方法之一[6]。純種發酵的豆豉風味遠遠不如傳統豆豉，李響等[7]研究表明，使用細菌和霉菌混合發酵可有效提高大豆發酵制品的品質特性。混菌發酵可以模擬傳統自然發酵過程中多菌協同作用的特點，有助于提升風味物質豐度及降低發酵過程控制難度，是提高豆豉風味品質和實現工業生產的重要途徑[8]。

在發酵過程中，微生物通過不同的酶活性降解大豆中大分子物質如蛋白質、碳水化合物和脂類，提供氨基酸、糖和脂肪酸的底物池，這些底物可以參與進一步的生物和化學反應，從而產生特有的味道和氣味[9]。制曲當中產生的蛋白酶在發酵過程中能分解大豆中的蛋白質，形成氨基酸，賦予豆豉固有的鮮味[10]。本研究從自然發酵豆豉中篩選出的3株高產蛋白酶菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）、溜曲霉（Aspergillus tamarii）混合發酵豆豉，采用單因素試驗及響應面試驗優化其后發酵階段工藝條件，并對其理化、微生物指標及酶活力進行分析。以期為闡明混菌發酵豆豉發酵工藝條件及品質形成機理提供一定的參考，為進一步縮短豆豉發酵周期和提高豆豉品質提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）、溜曲霉（Aspergillus tamarii）：分離自楚雄傳統發酵豆豉；黃豆、香辛料：市售；小麥粉：云南裕隆盛農業科技有限公司；食鹽：云南省鹽業有限公司；福林酚：上海如吉生物科技有限公司；無水碳酸鈉：濟寧博誠化工有限公司；氯化鈉、葡萄糖、三氯乙酸、氫氧化鈉：四川西隴科學有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖水、營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

HH-8數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；YXQLS-70A高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；V-5600紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；DHP-9082B恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；ST3100 pH計：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；SHA-F振蕩器：常州中貝儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；MLKRO200R高速冷凍離心機：德國Heidolph公司；HS153鹵素水分測定儀：瑞士梅特勒-托利多集團。

1.3 方法

1.3.1 豆豉加工工藝流程及操作要點

操作要點：挑選顆粒飽滿的大豆以豆水比為1∶8加入飲用水于室溫條件下浸泡6 h，瀝干水分后得到吸水后呈現脆性狀態的浸泡大豆，隨后將其裝入高溫高壓蒸煮袋密封并置于高溫高壓蒸煮鍋中，調整溫度為121 ℃蒸煮30 min，即可得到蒸熟大豆。將蒸熟大豆于無菌條件下冷卻，隨后按蒸熟大豆質量6.0%比例加入小麥粉并混勻。以Aspergillus tamarii（1×106CFU/mL）：Bacillus subtilis（1×107CFU/mL）：Meyerozyma caribbica（1×107CFU/mL）菌懸液的體積比為3∶1∶2，按0.60%接種量接種于蒸熟大豆及小麥粉混合物中進行制曲，制曲階段溫度為33 ℃，相對濕度為86%，時間為3 d，在制曲過程中每12 h取出于無菌操作臺進行翻曲，將結塊豉曲分散以使得制曲更均勻，制曲完成用80 ℃熱水冷卻后洗曲，入缸進行后發酵階段，后發酵過程以物料及食鹽水比為1∶1加入鹽水（7%）置于恒溫恒濕發酵箱進行固液發酵，缸口用無菌紗布覆蓋，發酵11 d后以豆豉質量5.0%比例添加辣椒粉、花椒粉4.0%、茴香粉1.0%、大蒜油2.0%拌勻即可制得豆豉成品。

取樣方法：其中樣品編號S0為蒸熟大豆，S1為制曲1 d的樣品，S2為制曲完成的樣品，S3為洗曲并添加食鹽水進入后發酵2 d的樣品（總發酵時間5 d），S4為后發酵5 d的樣品（總發酵時間8 d），S5為后發酵8 d的樣品（總發酵時間11 d），取這6個階段樣品進行分析。

1.3.2 豆豉后發酵工藝優化單因素試驗

在豆豉加工工藝的基礎上，分別考察發酵溫度（24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃）、食鹽添加量（3%、6%、9%、12%、15%）、發酵時間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）對感官評分和氨基酸態氮含量的影響，對發酵工藝條件進行優化。

1.3.3 豆豉后發酵工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以食鹽添加量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為自變量，以感官評分（Y）為響應值，進行3因素3水平的響應面試驗分析，豆豉后發酵工藝優化響應面試驗因素與水平見表1。

表1 豆豉后發酵工藝優化響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for process optimization of Douchi post-fermentation

1.3.4 分析檢測

水分含量的測定：采用HS153鹵素水分測定儀；pH值的測定：采用pH計；總糖和還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法[11]；蛋白酶活力的測定：參照GB/T 23527.1—2023《酶制劑質量要求第1部分：蛋白酶制劑》；淀粉酶活力：參照GB/T 24401—2009《α-淀粉酶制劑》；總酸和氨基酸態氮：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》；L*值、a*值、b*值的測定：采用色差儀[12]；游離氨基酸的測定：采用全自動氨基酸分析儀；菌落總數測定：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；霉菌、酵母菌總數測定：參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》；乳酸菌總數的測定：參照GB 4789.35—2023《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》。

1.3.4 感官評價

依據GB/T 29605—2013《感官分析食品感官質量控制導則》結合參考文獻制作豆豉感官評價標準，邀請10名經過感官培訓人員從形態、滋味、色澤和香氣4個方面對豆豉進行感官評價，滿分為100分，豆豉感官評分標準見表2。

表2 豆豉感官評分標準Table 2 Sensory score standards of Douchi

1.3.5 數據處理

采用Excel 2019、Origin 2022、GraphPad Prism 8等統計分析軟件進行數據分析及顯著性分析并作圖；采用Design-Expert 10.0.3設計軟件進行響應面試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 后發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度的確定

發酵溫度對氨基酸態氮含量和感官評分的影響見圖1。由圖1可知，當發酵溫度為24～36 ℃時，氨基酸態氮含量和感官評分逐漸增加；當發酵溫度為36 ℃時，感官評分及氨基酸態氮含量均達到最高值，分別為78.30分、0.764 g/100 g；當發酵溫度高于36 ℃后，氨基酸態氮含量和感官評分逐漸降低。因此，確定最佳發酵溫度為36 ℃。

圖1 發酵溫度對豆豉氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen contents and sensory score of Douchi

2.1.2 發酵時間的確定

由圖2可知，當發酵時間為2～10 d時，氨基酸態氮含量增加；隨著發酵時間在2～6 d的增加，感官評分逐漸增加；當發酵時間為6 d時，感官評分達到最大值，為76.70分，此時，氨基酸態氮含量為0.777 g/100 g；當發酵時間＞6 d時，感官評分逐漸下降。因此，確定最佳發酵時間為6 d。

圖2 發酵時間對豆豉氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen contents and sensory score of Douchi

2.1.3 食鹽添加量的確定

食鹽添加量對感官評分的影響見圖3。由圖3可知，食鹽添加量為3%～6%時，氨基酸態氮含量和感官評分均逐漸增加；當食鹽添加量為6%時，氨基酸態氮含量和感官評分均為最高值，分別為0.718 g/100 g、80.70分；當食鹽添加量＞6%時，氨基酸態氮含量和感官評分均逐漸降低。因此，確定最佳食鹽添加量為6%。

圖3 食鹽添加量對豆豉氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.3 Effect of salt addition on amino acid nitrogen contents and sensory score of Douchi

2.2 后發酵工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

在單因素試驗結果的基礎上，以食鹽添加量（A），發酵溫度（B），發酵時間（C）為自變量，以感官評分（Y）為評價指標，采用Design-Expert 10.0.3軟件進行Box-Benhnken試驗設計，確定豆豉后發酵工藝的最佳工藝參數，試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析結果見表4。

表3 豆豉后發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for process optimization of Douchi post-fermentation

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

通過響應面分析法分析后，得到感官評分與各因素變量的二次方程模型為：

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項P值為0.484 1，不顯著（P＞0.05），回歸方程的決定系數R2=0.957 2，調整決定系數R2Adj=0.902 1，說明該模型擬合程度良好；由P值可知，一次項B、二次項A2和B2對結果影響均為極顯著（P＜0.01），一次項A、交互項AB、二次項C2對結果影響均顯著（P＜0.05），其他項不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個因素對感官評分的影響次序為：發酵溫度＞食鹽添加量＞發酵時間。

2.2.2 響應面試驗分析

在響應面圖中響應曲線越陡峭，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著（P＜0.05），響應曲線越平緩，等高線呈圓形則說明交互作用不顯著（P＞0.05）。各因素間交互作用對感官評分影響的響應曲面及等高線見圖4。由圖4可知，3個響應因素在相對應的試驗范圍內都有響應極值，其中，食鹽添加量（A）與發酵溫度（B）兩兩交互時，響應曲面陡峭，等高線圖呈橢圓形，對感官評分影響顯著（P＜0.05），這與方差分析結果一致。

圖4 各因素間交互作用對感官評分影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on sensory score

通過響應面試驗結果分析，當食鹽添加量為7.26%、發酵溫度為33 ℃、發酵時間為8.24 d時，感官評分預測值為89.38分。考慮到實際情況，將后發酵工藝條件修正為食鹽添加量7%，發酵溫度33 ℃，發酵時間8 d。在此條件下進行驗證，重復試驗3次，感官評分實際值為86.33分，與預測值的相對誤差較小，說明該模型準確可靠。

2.3 豆豉發酵過程中理化成分分析

2.3.1 豆豉發酵過程中水分、總酸、pH、還原糖、總糖含量變化

豆豉發酵過程中水分、總酸和pH、還原糖和總糖含量的變化見圖5。

圖5 發酵過程中水分（A）、總酸和pH（B）、還原糖和總糖含量（C）變化Fig.5 Changes in moisture (A), total acid and pH (B), reducing sugar and total sugar contents (C) during fermentation process

由圖5A可知，S0～S2階段的水分含量逐漸下降；樣品S2的水分含量為45.28%，該時期可能由于微生物急劇生長需要吸收利用水分導致水分含量下降；S2～S3階段，水分含量上升至63.35%，洗曲明顯增加了豆豉的水分含量；S3～S5階段，樣品的水分含量下降；發酵完成時，樣品S5的水分含量為23.76%。

由圖5B可知，發酵過程中，pH值與總酸含量（以乳酸計）變化恰好相反，S0～S1階段，樣品的pH值下降，總酸含量上升；S1～S4階段，樣品的pH值上升，總酸含量下降；S4～S5階段，樣品的pH值有所下降，總酸含量有所上升；樣品S5的pH值為7.48，總酸含量為0.22 g/100 g。

由圖5C可知，S0～S5階段，還原糖含量和總糖含量下降；樣品S5總糖含量為5.40 g/100 g，還原糖含量為2.17 g/100 g。制曲及發酵階段顯著降低還原糖和總糖含量（P＜0.05）。研究結果表明，豆豉還原糖和總糖含量隨著發酵進行降低，本研究結果與其他研究結果一致[15-16]。

2.3.2 發酵過程中顏色參數的變化

豆豉發酵過程中顏色參數的變化見圖6。由圖6可知，S0～S2階段，樣品的的L*值、a*值、b*值均呈下降趨勢，即亮度、紅度值和黃度值下降，而在S2～S3階段，豆豉的L*值、a*值、b*值均增加，即亮度、紅度值和黃度值上升；S3～S5階段，樣品的L*值、a*值呈現先下降后上升的趨勢，而b*值呈下降趨勢，發酵完成時，L*值、a*值、b*值分別為65.03、6.10、19.83。結果表明，發酵能明顯改變大豆色澤，索化夷等[12]對發酵時間長達200 d左右的永川豆豉進行研究發現，其顏色向黑色轉化，最終呈現黑色，并且分析發現豆豉L*值變化與其氨基酸態氮含量呈負相關。

圖6 發酵過程中顏色參數的變化Fig.6 Changes in color parameters

2.3.3 發酵過程中氨基酸態氮含量變化

發酵過程中氨基酸態氮含量變化見圖7。由圖7可知，S0～S2階段，氨基酸態氮含量逐漸增加；S2～S3階段，氨基酸態氮含量逐漸下降，可能是由于洗曲后大量小分子物質流失溶于水流失而導致的[18-19]。S3～S5階段，氨基酸態氮含量逐漸增加，發酵結束時，氨基酸態氮含量為0.77 g/100 g，與周鑫等[17]對不同廠家豆豉測定的氨基酸態氮含量相比，其含量較高。因此，在發酵過程中應優化洗曲這一過程，從而保證發酵對原料營養成分最大限度的保留，從而提高豆豉品質。

圖7 發酵過程中氨基酸態氮含量變化Fig.7 Changes in amino acid nitrogen content during fermentation process

2.3.4 發酵過程中游離氨基酸含量變化

游離氨基酸是豆豉發酵過程中滋味和風味的重要前體物質，是衡量豆豉風味的一個重要指標[20]。豆豉發酵過程中17種游離氨基酸的含量變化見表5。

表5 發酵過程中17種游離氨基酸的含量變化Table 5 Changes in the 17 free amino acids content during fermentation process

由表5可知，在發酵的不同階段，豆豉中的游離氨基酸種類沒有變化，均為17種。蒸熟大豆（S0）中17種游離氨基酸總含量為0.274 mg/g，其中精氨酸含量最高，為0.094 mg/g，其次為谷氨酸和組氨酸，其含量分別為0.031 mg/g、0.023 mg/g，其他氨基酸雖然都有檢出，但含量較少。樣品S1谷氨酸含量由0.031 mg/g升高至1.053 mg/g，而精氨酸含量則增長至0.554 mg/g，亮氨酸含量由0.007 mg/g增長至0.465 mg/g，這3種氨基酸含量增長幅度較大，并且在該階段其余的氨基酸含量均出現不同程度的增加，此階段17種游離氨基酸總含量增長最快，由0.274 mg/g增長至4.978 mg/g。制曲完成（S2）17種游離氨基酸含量都達到最大值，其中，谷氨酸含量最高，為1.944 mg/g。由此可見制曲階段是游離氨基酸產生的關鍵時間，含量提升最多。在S2～S3階段，游離氨基酸出現了明顯的下降，總游離氨基酸降低至0.578 mg/g，并且在S3～S4階段依舊持續下降，在發酵結束時（S5）出現小幅度的上升，最終總游離氨基酸含量為0.319 mg/g，相比較蒸熟大豆含量有所提高，分析其原因可能是因為有大量水溶性游離氨基酸在洗曲后溶于水而流失，并且有研究表明，食鹽的加入會導致微生物對蛋白質的降解能力減弱，對蛋白酶產生抑制作用，從而導致游離氨基酸的含量降低[21]。在豆豉發酵過程中17種游離氨基酸含量變化趨勢與梁如等[22]的研究一致，但含量存在一定差異，分析原因可能為發酵所用菌種及工藝條件不同所致。后發酵過程中游離氨基酸含量相比較制曲完成時出現較大程度下降，但豆豉的氣味、質地和色澤都得到了較大的提升。

2.4 發酵過程中豆豉微生物動態變化

發酵本就是利用微生物將大分子物質分解轉化為更利于人體消化吸收的營養物質，經過微生物的分解利用，進一步提高原料的營養性與功能性[23]。所以在發酵過程中微生物具有主導作用，分析發酵過程中微生物指標的變化，結果見圖8。

圖8 發酵過程中微生物總數變化Fig.8 Changes in total number of microorganisms during fermentation process

由圖8可知，S0～S2階段，細菌總數、乳酸菌總數、霉菌總數及酵母菌總數對數值均增加；樣品S2微生物數量均達到最大值，此時，細菌總數對數值為7.69，乳酸菌總數對數值為2.47，霉菌總數對數值為8.29，酵母菌總數對數值為7.81。S2～S3階段，細菌總數、乳酸菌總數、霉菌總數及酵母菌總數對數值都急速降低，一般而言，霉菌型豆豉都需要經過洗曲這一步驟，洗曲是用溫度高于85 ℃的熱水冷卻后用來沖洗制曲完成的豆粒表面的菌絲，可以使發酵豆豉呈現更好的色澤，并且減少霉菌發酵具有的苦味[24]。S3～S5階段，除乳酸菌總數對數值逐漸下降，其他微生物菌落總數對數值下降至最低，發酵結束時，細菌總數、乳酸菌總數、霉菌總數及酵母菌總數對數值分別為3.13、0.97、3.44、2.12。其原因可能是，該階段豆豉已經成熟，水分含量較低，大多數微生物因為缺水大量死亡從而使菌落總數出現下降[25]。

2.5 不同發酵階段酶活力變化

發酵過程中蛋白酶和淀粉酶活力變化見圖9。由圖9可知，在整個發酵過程中，蛋白酶與淀粉酶活力變化情況一致。蛋白酶與淀粉酶活力均在制曲階段（S0～S2）出現較快增長，與微生物總數的急劇升高趨勢一致，酶活力的升高可加快對原料大分子物質的分解，為后發酵過程提供反應底物[26-27]；樣品S2的蛋白酶與淀粉酶活力均達到最大值，分別為590 U/100g，24 U/100 g；在S3～S4階段，蛋白酶與淀粉酶活力均呈下降趨勢；在S4～S5階段，蛋白酶與淀粉酶活力有所提高，發酵結束時，蛋白酶與淀粉酶活力分別為322 U/100 g、13 U/100 g。與蘭光群[28]采用兩株菌混合發酵納豆所產生的中性蛋白酶活力相比（其蛋白酶活力為88.78 U/g）較高。

圖9 發酵過程中蛋白酶和淀粉酶活力變化Fig.9 Changes in protease and amylase activities during fermentation process

3 結論

豆豉后發酵的最佳發酵工藝條件為：食鹽添加量7%，發酵溫度33 ℃，發酵時間8 d。在該優化條件下，發酵所得豆豉感官評分為86.33分。發酵結束時，豆豉水分含量為23.76%；還原糖、總糖以及總酸含量也出現了降低，分別為2.13 g/100 g、5.40 g/100 g、0.22 g/100 g；總游離氨基酸含量為0.319 g/100 g，氨基酸態氮含量為0.77 g/100 g。本研究對混合菌株接種發酵制備快速發酵豆豉具有一定意義，有助于解決傳統發酵豆豉半開放式制曲帶來的食品安全風險，未來還可以進行多菌種發酵劑研制，提高發酵豆豉的品質。