清香大曲中高耐受性功能酵母的篩選

牟飛燕，夏博宇，張 維，董孝元，陳 暉，常 煦，陳茂彬，方尚玲*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 工業發酵省部共建協同創新中心 湖北省工業微生物重點實驗室發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業有限公司，湖北 武漢 430068；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

白酒以“多菌共酵”體系為基礎，在世界各種蒸餾酒之中無出其右，白酒早已成為中國人民生活和文化的重要組成部分[1]。近期，專家提出應促進我國白酒國際標準的形成，讓我國白酒得到合理分類及身份界定，鼓勵中國白酒申請加入世界非物質文化遺產行列以此提升中國白酒文化在國際上的地位和認可度，我國白酒走向世界指日可待。

固態白酒釀造過程中各種微生物相互影響共同代謝發酵，在白酒的不同發酵階段中都有不同的優勢釀造微生物菌群和菌群結構組成，這些核心微生物不僅使發酵食品在其風味上具有標志性和豐富性，而且對穩定產品質量提供了重要保障[2]。清香型大曲白酒具有清雅純正的香氣特點，其釀造工藝的特點是清蒸清燒、地缸發酵、清蒸二次清[3]，大曲作為釀造過程中的糖化生香劑，其質量的優劣直接影響著成品酒的產量和品質，大曲中的微生物種類和豐度對白酒釀造至關重要，在大曲酒發酵過程中起主要作用的是酵母菌、細菌和霉菌[4]。

功能菌研究多以改善白酒風味和質量為目標，由于傳統制曲方法容易受環境因素影響而造成曲質量層次不齊且波動大。因此通過篩選并利用功能菌來增進曲的利用效果、豐富大曲的微生態環境，使得白酒特征香氣成分得到改善。近年來隨著對大曲中功能菌的不斷深入研究，已經從大曲中分離篩選出上千種微生物菌種，許多廠家開始將有益功能菌投入傳統白酒的生產中，以提高酒醅和大曲中功能菌的種類和數量，提升白酒的質量，并取得了階段性的成果[5-6]。

酵母菌對產酒、生香等方面都有重要影響，與白酒的出品率和特征香氣成分息息相關，在清香型大曲中，酵母菌的作用早已經跨越了純粹的發酵[7]。因此，對大曲中功能性酵母菌的研究勢在必行，從清香型白酒酒曲中篩選新的優良功能性酵母是使白酒出酒率和酒質持續提升的重要方法[8]。酵母菌主要分為釀酒酵母和非釀酒酵母兩大類。其中起作用多的主要有釀酒酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、假絲酵母屬（Candida）、漢遜酵母屬（Hansenula）等[9]。

由于在實際生產中，酵母菌會受到高溫環境、強酸環境、高乙醇環境、高糖環境等脅迫條件的影響，因此生產中對菌株在窖池環境中的適應性有一定的要求，高耐受性的酵母菌更有助于發酵生產，是進行工業應用的基礎[8]，目前國內外對于高耐受的酵母菌的研究著重于酒樣、醬香型白酒大曲與濃香型白酒大曲，對清香型大曲研究較少。本研究以清香型大曲中酵母菌為研究對象，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC）顯色法初篩，通過發酵力、產酒及產香能力進行復篩，并對篩選菌株進行分子生物學鑒定，旨在獲得高產菌株并開展對生存環境的耐受性，以獲取耐受性優良的功能性酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

清香型白酒大曲：湖北省某酒廠。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）、無水乙醇、葡萄糖、KH2PO4、NaOH、HCl、MgSO4、NaCl（均為分析純）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

馬丁培養基：KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L、孟加拉紅溶液3 mL/L、蒸餾水1 000 mL。121 ℃條件下滅菌15 min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：酵母浸粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、蒸餾水1 000 mL。121 ℃條件下滅菌15 min。

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培養基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、蒸餾水1 000 mL（pH調至中性）[10]。121 ℃條件下滅菌15 min。

半固態發酵培養基：取高粱粉700 g，加入420 mL開水，潤糧20 h后取出，在121 ℃下蒸糧30 min、加入100 mL開水復水20 min、再次于121 ℃下蒸糧20 min，再加入120%的開水。待溫度降至90 ℃時加入2%淀粉酶（2 000 U/g），88～90 ℃保溫水解1 h。待溫度降至55 ℃時加入2%糖化酶（50 000 U/g）保溫糖化1 h，糖化結束后取1滴與碘液反應，碘液不顯藍色即為反應徹底。過濾得濾液，調糖度為12°Bx。115 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LRH-250生化培養箱：上海智城分析儀器有限公司；WFJ 2000紫外分光光度計：江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；5977B-7890B氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲菌懸液的制備

稱取10 g粉碎過篩后的大曲，加入90 mL的0.9%生理鹽水中，于30 ℃、120 r/min搖床振蕩20～30 min，用紗布過濾，并按10倍梯度逐級稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6。

1.3.2 酵母菌的分離及純化

分別吸取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液150 μL涂布于馬丁培養基，于30 ℃培養箱培養48 h。挑取生長較好的、菌落形態不一的單菌落，接種于YPD培養基培養，多次劃線分離，直至得到純種單菌落。

1.3.3 酵母菌的初篩

將分離獲得的酵母菌接種于YPD固體培養基，在30 ℃條件下培養24 h后在其上覆蓋一層TTC顯色劑[11]，于30 ℃恒溫培養3 h，取出，觀察其顏色，初篩出顯色較深、生長良好的菌株。

1.3.4 酵母菌的復篩

（1）酵母菌發酵力測定

將經兩次劃線活化的酵母菌接種于YPD液體培養基中，30 ℃條件下培養72 h獲得種子液。按1%（V/V）接種量將種子液接種于半固態高粱發酵培養基（模擬窖池環境），裝液量為100 mL/250 mL，28 ℃條件下振蕩培養72 h，采用發酵栓法[12]測定發酵力。

（2）酵母菌產乙醇能力測定

將種子液按10%的接種量接種于半固態高粱發酵培養基，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下培養7 d，采用蒸餾法[13]測定酒精度，取100 g發酵產物和200 mL的水于1 000 mL蒸餾瓶中，緩慢蒸餾，收集100 mL餾出液，冷卻至室溫，用酒精計法測得酒精體積分數示值和溫度，換算成20 ℃下的酒精體積分數。

（3）酵母菌產香能力的檢測

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于半固態高粱發酵培養基， 裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下培養72 h。 利用頂空固相微萃取 （headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）氣質聯用（GC-MS）法[14]對其發酵產物進行檢測分析。

1.3.5 篩選酵母菌的鑒定

對具有優良產酒生香的酵母菌進行分子生物學鑒定，引物設計為通用引物：ITS1/ITS4， 引物序列分別為5'-TCC- GTAGGTGAACCTGCGG-3' 和5'-TCCTCCGCTTATTGA- TATGC-3'，PCR擴增產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，將最終測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，并對近似序列進行系統發育學分析[15]。

1.3.6 酵母菌的耐受特性分析[16-19]

將篩選菌株的種子液按5%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養基中，30 ℃培養2 d， 用紫外分光光度計在波長600 nm處測定發酵液OD600nm值， 考察菌株在溫度（27℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃）、pH值（2、3、4、5、6、7）、葡萄糖質量濃度（50 g/L、100 g/L、200 g/L、400 g/L、600 g/L）及乙醇體積分數（3%、6%、9%、12%、15%）條件下的生長情況。

1.3.7 數據處理

使用Excel 2019、SPSS Statistics 26.0對數據進行統計分析處理，柱狀圖與折線圖由GrapHPad Prism 9.0繪制而成、揮發性化合物的熱圖及Venn圖利用Chiplot和Hiplot軟件繪制，酵母菌基于18S rRNA基因序列的系統發育樹在Mega-X軟件中制作。

2 結果與分析

2.1 清香型大曲中酵母菌的分離純化

對培養48 h的稀釋涂布的平板進行菌落形態觀察，根據菌株在馬丁培養基上的不同菌落特征，共分離獲得22株酵母菌，從細胞形態上分為橢圓形、卵圓形和有假絲的卵圓形三大類，其繁殖方式均為出芽生殖，具體菌落形態和細胞形態見表1。

表1 大曲中篩選酵母菌的菌落和細胞形態Table 1 Colony and cell morphology of screened yeasts from Daqu

2.2 酵母菌TTC顯色初篩

根據菌株產酒能力越強，TTC顯色越明顯的原理，22株分離菌株顯色反應結果見表2。

表2 分離酵母菌的TTC初篩結果Table 2 TTC preliminary screening results of 22 isolated yeast strains

由表2可知，根據TTC初篩結果，從22株酵母菌中篩選得到7株菌株（A-2、B-6、C-2、C-3、D-10、D-11、YC-3）菌落呈紅色或深紅色。 因此，選擇這7株菌株進行后續發酵力、產酒力、產香能力研究。

2.3 酵母菌的復篩

2.3.1 酵母菌的發酵力與產酒力

分離出的酵母菌的發酵力與產酒力測定結果見圖1。

圖1 7株酵母菌的發酵力（A）與產酒力（B）測定結果Fig.1 Determination results of fermentation power (A) and alcohol production capacity (B) of 7 yeast strains

由圖1A可知，7株酵母菌的發酵力在52～106 g（CO2）/（10 mL·72 h）之間，其中菌株B-6的發酵力最高，達到了106 g（CO2）/（10 mL·72 h），菌株C-3和YC-3次之，菌株A-2、C-2、D-10、D-11的發酵力較低，菌株B-6、C-3與YC-3

由圖1B可知，將TTC初篩選擇出的7株酵母菌培養7 d，采用蒸餾法測其產酒力，其中菌株C-3的產酒能力顯著高于其他酵母菌（P＜0.05），單菌發酵產物的酒精度為5.15%vol，屬于目前較高水平[20-21]。菌株B-6酒精度為3.02%vol，其余5株菌產酒能力均不高。

2.3.2 酵母菌的產香能力

白酒中含有1 500多種微量成分，如酯類、醇類、酸類、醛酮類、吡嗪類等，這些微量成分雖然含量低，但是其種類與比例對白酒最終的風味及口感的影響非常大。不同品種的酒曲，不同發酵條件，產生的香氣成分的種類和含量都不同，以此造就各種酒的不同風味[22]。

通過HS-SPME-GC-MS法對7株酵母菌的半固態高粱發酵產物的香氣成分進行檢測，結果見圖2。由圖2可知，7株酵母菌發酵產物共檢測出54種香氣成分，包括24種酯類、10種醇類、9種酸類、6種醛酮類、5種其他類。

圖2 7株酵母菌發酵產物香氣成分分析Fig.2 Analysis of aroma components in 7 yeast strains fermentation products

由圖2A可知，菌株B-6產酯類物質相對含量占比最高，達到86.7%，酯是具有芳香性氣味的揮發性化合物，是白酒中的主要香味成分，對形成各種酒的典型風格起著關鍵性作用[23]，另外菌株D-10、D-11、C-3產香氣種類較多，分別有32種、27種、20種。由圖2B可知，7株酵母菌共有香氣成分為苯乙醇和乙酸苯乙酯兩種，其中苯乙醇為玫瑰花香、月季花香、花粉香味，能提高酒體的風味與品質，是十分重要的天然香味物質[24]，菌株D-10、D-11擁有獨特的香氣成分種類較多。由圖2C可知，菌株B-6的乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯相對占比顯著高于其他菌種，乙酸苯乙酯有甜味，帶有玫瑰花香和粉香的蜂蜜樣香氣，類似蘋果樣的果香，并帶有可可和威士忌樣的香韻[25]。乙酸異戊酯具有香蕉和梨的氣味，菌株B-6的發酵產物的確具有強烈的熟香蕉果味。菌株B-6、D10、D11產乙酸乙酯相對占比均在10%左右，這與清香型白酒以乙酸乙酯為主體香味相符合。菌株C-3主要產醇類物質，相對含量占比達60%，菌株C-3還產法尼醇，是清香型白酒的關鍵萜烯類化合物，主要由釀酒酵母產生[26]。

對初篩得到的7株酵母菌的發酵力、產酒力以及產香能力進行檢測，其中菌株B-6與C-3的發酵力和產酒力水平在7株酵母菌中均較高，菌株C-3、D10與D11產香種類多，菌株B-6產酯種類多且有特殊香氣。綜上，選擇菌株B-6、C-3、D10與D11進行分子生物學鑒定。

2.4 酵母菌分子生物學鑒定結果

對高發酵力和產酒能力強的菌株B-6與C-3、產香能力強的菌株D-10和D-11進行菌種鑒定，四株酵母菌的系統發育樹見圖3。

圖3 篩選酵母菌基于18S rRNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of screened yeasts based on 18S rRNA gene sequence

由圖3可知，菌株B-6與費比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、菌株C-3與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、菌株D-10與扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、菌株D-11與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）聚于一枝，親緣關系最近，結合形態特征，菌株B-6被鑒定為費比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、菌株C-3被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、菌株D-10被鑒定為扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、菌株D-11被鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

2.5 功能酵母菌耐受性

在制曲和釀酒過程中，其溫度是在波動的，選育優良的耐高溫菌株是實現某些工藝的前提[27]。由圖4A可知，4株酵母菌均在30 ℃或者33 ℃時生長狀況更好，其中菌株B-6的高溫耐受性最好，在33 ℃的生長狀況比30 ℃更好；后續隨著溫度的升高，生長狀況逐漸降低；在39 ℃高溫時，生長狀況明顯高于其他3株酵母菌。耐高溫能力最差的是菌株D-10，在39 ℃以上高溫時，基本不生長。

圖4 4株功能酵母的耐受性試驗結果Fig.4 Tolerance tests results of 4 functional yeast strains

通常情況下，高酸環境不利于酵母菌的生長繁殖[28]。由圖4B可知，菌株B-6和C-3在pH值為3時生長狀況依然良好，在pH值為2時亦可以生長，而菌株D-10和D-11在pH值為6之后生長狀況隨著酸度升高急速下降，相對而言，菌株B-6和C-3的耐酸性更好。

在固態白酒的發酵過程中，隨著酒精度的升高，酵母的生長繁殖會受到抑制，酵母會產生一系列的應激反應來保證正常的生長代謝，而酵母的應對機制也稱作酵母的酒精耐受性，酵母菌是固態白酒釀造時產酒精最主要的菌種，所以具有一定的乙醇耐受性十分必要[29]。由圖4C可知，4株酵母菌均耐體積分數為9%乙醇，其中菌株C-3的耐酒精能力最好，在乙醇體積分數為9%～15%之間的生長狀況降低較少，OD600nm值只降低了52.5%，而另外三株酵母菌OD600nm值降低了80%左右，隨著乙醇體積分數升高，菌株C-3與其余幾株酵母比較，生長狀況較好。

糖是發酵生產乙醇的主要基質和酵母賴以生存的能源物質，但是高濃糖環境對酵母生長繁殖有抑制作用，高滲透壓會導致酵母細胞水分流失[30]。由圖4D可知，4株酵母在葡萄糖質量濃度為50～600 g/L時，隨著環境中糖度的升高，生長狀況變差，其中菌株C-3在高糖環境下的生長狀況略好于其他三株酵母菌，菌株B-6的耐高糖能力相對較弱，葡萄糖質量濃度在600 g/L時，生長狀況差，葡萄糖質量濃度在400～600 g/L時，其OD600nm值降低了83.9%。

綜上，功能性酵母菌B-6對高溫（39 ℃）和強酸環境（pH值為3）具有高耐受性、在12%vol高乙醇環境下可以生存，具有較好的耐乙醇能力；菌株C-3在高溫39 ℃、酒精度12%vol、pH值為3、葡萄糖質量濃度400 g/L的環境下均可以生存。因此，菌株B-6和C-3耐受性比其他兩株菌更強。

3 結論

本研究從清香型大曲中篩選得到4株菌，通過形態學觀察及分子生物學鑒定，菌株B-6為費比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、菌株C-3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、菌株D-10為扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、菌株D-11為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。通過耐受性實驗，獲得了耐受性良好菌株B-6和C-3。高耐受性的酵母菌可以在不同發酵環境下作用，不但可以有效解決釀酒糖化過程前的酸堿調節等問題，減少釀酒過程中不必要的環節，降低釀酒生產成本，還可以有效提高工業生產的產酒率、增強其香氣和品質；而菌株D-10、D-11作為生香酵母，雖然耐受性一般，但產獨特香氣成分種類較多，后續可從此方向對其進行研究。