產幾丁質酶高原菌的分離鑒定及酶學性質初步研究

權淑靜，楊文玲，雷 高，王佰濤，刁文濤，梁 博，劉德海*

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450008；3.河南省高新技術實業有限公司，河南 鄭州 450008）

幾丁質（聚β-1,4-N-乙酰-D-葡糖胺）是一種β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物，也稱甲殼素，是自然界中僅次于纖維素存在的第二大多糖[1]，其主要來源于真菌細胞壁、昆蟲外骨骼和甲殼類動物[2]。據估計，在自然界幾丁質每年產量約為1 010～1 011 t，是地球上最豐富的未被充分開發的生物質資源之一[3]。在原生狀態下，幾丁質以有序的晶體微纖維形式存在，不溶于水、稀酸、堿和其他有機溶劑，在濃酸中不穩定，易發生糖苷鍵的斷裂[4]。采用適當的方法降解幾丁質，可得到不同聚合度的水溶性幾丁寡糖（chitin oligosaccharides，NACOS）或殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）及其衍生物。作為一種功能性生物聚合物，幾丁質降解產物具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保濕補水及增強機體免疫功能等多種生物活性，因其生物相容性、細胞膜滲透性和可生物降解等獨特特性，受到了廣泛的關注[5]，被應用于醫藥、化妝品、食品和農業等多個行業[6-9]。

目前，制備幾丁寡糖的方法主要有化學法、物理法和生物法[10]，這些方法各有優點和局限性。不同水解方法提供了不同分子質量和脫乙酰程度的殼聚糖，影響其組成、收率和功能[11]。化學法以酸水解為主，簡單、高效，但是殼聚糖顆粒中的剛性結晶區域會抑制酸的滲透。因此，在大多數研究中使用的是5～12 mol/L的高濃度酸。過多的酸負荷會導致葡萄糖胺降解，從而顯著降低產量，導致產品品質不均、副產物多，另外還會造成嚴重的設備腐蝕和環境污染問題[12]。物理法有超聲、微波[13]、伽馬輻射[14]等方式，缺點是能耗高。生物法主要是生物酶法，利用專一性幾丁質酶或非專一性酶對幾丁質進行水解，其具有聚合程度可控、副產物少、反應條件溫和、綠色環保等優點[10]。

幾丁質酶來源十分廣泛，多種產幾丁質酶的菌株已被報道，主要包括曲霉屬（Aspergillus）[15]、鏈霉菌屬（Streptomyces）、沙雷菌屬（Serratia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）[16-17]，還包括粘球菌屬（Mucococcus）[18]、發光桿菌屬（Photobacterium）和希瓦氏菌屬（Shewanella）[19]等，但這些菌株所產幾丁質酶存在酶活力不高、生產周期長、成本高等問題。近年來，國內產幾丁質酶菌株的研究多集中在海洋微生物資源的發掘[20-23]，對于內陸土壤尤其是高原菌開展的研究較少。“世界屋脊”青藏高原地形及環境特殊，有大量特色微生物資源亟待挖掘。因此，本研究采用透明圈法及酶活力測定從日喀則地區采集的土壤樣品中分離、篩選高產幾丁質酶的菌株，并對所獲得的菌株進行鑒定及酶學性質研究，以期發現所產幾丁質酶的特性，為后期利用其幾丁質酶基因構建工程菌并在生產上應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土壤樣品：采自西藏日喀則地區（北緯29°14′11″，東經88°53′59″，海拔3 685 m）。

1.1.2 溶液及培養基

5%的膠體幾丁質溶液：稱取10 g粉末幾丁質加入到200 mL濃鹽酸中，蓋保鮮膜，于磁力攪拌器攪拌過夜；將酸解后的液體倒入預冷的2.5 L蒸餾水中，攪拌均勻，4 ℃靜置過夜；8 000 r/min離心10 min，將上清液倒出，加入預冷的蒸餾水重懸，再靜置，多次反復，直到懸濁液pH為5.0；最后將離心后的膠體加入200 mL去離子水。

初篩培養基[22]：膠體幾丁質1%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，ZnSO40.001%，瓊脂2%，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

復篩培養基（發酵培養基）[22]：膠體幾丁質1%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，ZnSO40.001%，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 試劑

革蘭氏染色試劑盒、幾丁質、幾丁質酶活檢測試劑盒（微量法）：北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）StarMix：北京康潤誠業生物科技有限公司；菌株16S rDNA基因PCR擴增通用引物27F、1492R、D2000 Plus DNALadder：北京六合華大基因科技有限公司；GF254薄層層析（thin layer chromatography，TLC）板：德國Merck公司；幾丁寡糖（≥98%）：青島和海生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DRP-9052型電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；QYC-2012C恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；Multifuge X1R離心機：德國Thermo公司；Thermoblock PCR擴增儀：德國Biometra公司；System蛋白質雙向電泳系統、ChemiDoc XRS+化學發光成像分析系統：美國Bio-Rad公司；Axio Image M2全電動正置熒光顯微鏡：德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 產幾丁質酶菌株的篩選

初篩：采用梯度稀釋法分離菌株。稱取10 g土樣加入90 mL放有玻璃珠的蒸餾水中，打散后涂布于初篩培養基平板，28 ℃培養至透明圈產生，挑選透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值大的菌株作為初篩菌株。

復篩：將初篩獲得的菌株接種于復篩培養基中，28 ℃、180 r/min搖床培養36～48 h，8 000 r/min離心10 min后取上清獲得粗酶液，37 ℃測定粗酶液中幾丁質酶活性，比較酶活力大小，選取酶活最高的菌株。

1.3.2 幾丁質酶活力的測定

參照幾丁質酶活檢測試劑盒說明書測定幾丁質酶活性。幾丁質酶活力定義為：在一定的反應條件下，每毫升液體每小時分解幾丁質產生1 μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。

1.3.3 高產幾丁質酶菌株的鑒定

形態學觀察：將分離純化的單菌落接種到NA培養基平板上，28 ℃倒置培養24～48 h，觀察菌落特征；對細菌進行染色，通過光學顯微鏡觀察形態。

生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》[24]對菌株進行生理生化鑒定。

分子生物學鑒定：使用Omega細菌基因組提取試劑盒獲得篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采取通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增16S rDNA基因序列片段。PCR擴增體系：2×TaqPCR StarMix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，超純水9.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環；72 ℃再延伸10 min。將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結果在ezbiocloud網站中進行比對分析，利用MEGA6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 粗酶液酶學性質初步研究

最適溫度以及溫度穩定性：在不同溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）下測定粗酶液的酶活力，確定最適反應溫度。將粗酶液在不同溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）下保溫2 h后測定剩余酶活。以最大酶活力值計為100%，計算出其余處理的相對酶活。

最適pH以及pH穩定性：在不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）條件，最適反應溫度下測定酶活力，確定最適反應pH。將粗酶液在不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）緩沖液體系中4 ℃放置2 h，最適反應溫度條件下測定剩余酶活。以最大酶活力值計為100%，計算出其余處理的相對酶活。

不同金屬離子及化合物對酶活力的影響：在不同處理中加入Mg2+、Ba2、Zn2+、Mn2+、Fe2+、K+、Ca2+、Cr2+、Ag+、Co2+、Na+、Tween-80、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），使其在反應體系中終濃度為2 mmol/mL，在最適反應溫度、pH條件下測定酶活力。以未加金屬離子及化合物的酶活力為100%，計算出其余處理的相對酶活。

1.3.5 粗酶液對幾丁質的降解產物分析

將粗酶液與底物膠體幾丁質以1∶1比例混合，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃條件下反應12 h，沸水浴5 min終止反應，離心，取上清液進行薄層層析[25]，上樣量5 μL，以幾丁單糖和幾丁寡糖（N-乙酰氨基葡萄糖、幾丁二糖、幾丁三糖、幾丁四糖）含量分別為10 mg/mL的混合溶液為標樣，陰性對照為緩沖液代替底物反應的上清液。展層劑為正丁醇-乙酸-水（2∶1∶1，V/V），展層結束后吹干，均勻噴灑顯色劑（二苯胺1 g、苯胺1 mL、丙酮50 mL、磷酸5 mL），85 ℃條件下顯色10 min。

2 結果與分析

2.1 高產幾丁質酶菌株的篩選

采用透明圈法從日喀則地區土壤中分離篩選到16株產透明圈的菌株，進一步經酶活測定復篩，最終獲得5株產幾丁質酶菌株，其幾丁質酶活力見圖1。由圖1可知，5株菌株的幾丁質酶活力為49.77～242.36 U/mL，其中菌株RGZ2-4-5的幾丁質酶活力最高，為242.36 U/mL。因此，選擇菌株RGZ2-4-5為高產幾丁質酶的菌株。

圖1 產幾丁質酶菌株篩選結果Fig.1 Screening results of chitinase-producing strains

2.2 菌株RGZ2-4-5的鑒定

2.2.1 形態學觀察

菌株RGZ2-4-5的菌落及細胞形態見圖2。由圖2可知，菌株RGZ2-4-5的菌落呈乳白色，半透明狀，為邊緣規則的圓形，表面光滑、濕潤，革蘭氏染色為陰性，細胞呈棒狀。

圖2 菌株RGZ2-4-5的菌落（a）及細胞（b）形態特征Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain RGZ2-4-5

2.2.2 生理生化試驗

菌株RGZ2-4-5的生理生化鑒定結果見表1。由表1可知，菌株RGZ2-4-5的氧化酶、接觸酶試驗結果呈陽性，能使明膠液化、Tween-80水解。結合形態觀察，參照《常見細菌系統鑒定手冊》初步鑒定菌株RGZ2-4-5為馬賽菌屬（Massiliasp.）。

表1 菌株RGZ2-4-5的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain RGZ2-4-5

2.2.3 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構建菌株RGZ2-4-5的系統發育樹，結果見圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株RGZ2-4-5的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain RGZ2-4-5 based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株RGZ2-4-5的16S rDNA基因序列與Massilia aquaticaFT 127WT聚于同一分支，親緣關系最近。基于形態學觀察、生理生化試驗和分子生物學技術，最終鑒定菌株RGZ2-4-5為Massilia aquatica。

2.3 菌株RGZ2-4-5產幾丁質酶酶學性質初步研究

2.3.1 溫度對幾丁質酶活力的影響及溫度穩定性

由圖4可知，在30～60 ℃之間，幾丁質酶活力隨反應溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，當反應溫度為50 ℃時，酶活力最高，為223.06 U/mL。因此，確定最適反應溫度為50 ℃。由圖4亦可知，溫度越低，幾丁質酶越穩定，40 ℃以下保溫處理2 h，酶活力能保持在60%以上，高于40 ℃后迅速失活，50 ℃保溫2 h后相對酶活力僅為24.21%。結果表明，菌株RGZ2-4-5所產的幾丁質酶不耐高溫，屬于中低溫幾丁質酶。

圖4 溫度對菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶活力和穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of chitinase produced by strain RGZ2-4-5

2.3.2 pH對幾丁質酶活力的影響及pH穩定性

由圖5可知，菌株RGZ2-4-5所產的幾丁質酶粗酶液在pH為4.0～10.0范圍內酶活力較高，且隨著pH的升高，酶活力呈先升高后下降的趨勢，當pH為5.0時，酶活達到最高，為259.69 U/mL，說明該酶的最適反應pH為5.0。由圖5亦可知，粗酶液在pH5.0～7.0條件下處理后仍保持70%以上酶活；pH＞7.0以后酶活下降迅速，pH為8.0時相對酶活為36.41%，pH為10.0時相對酶活僅為5.15%。結果表明，該酶pH適應范圍廣，在酸性條件下比較穩定。

圖5 pH對菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶活力及穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of chitinase produced by strain RGZ2-4-5

2.3.3 金屬離子及化合物對幾丁質酶活力的影響

由圖6可知，與CK相比，Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cr2+、Ag+、Co2+及PMSF處理的相對酶活顯著降低（P＜0.05），說明這幾種金屬離子對該酶有顯著的抑制作用，其中，Zn2+、Mn2+、Fe2+、Ag+處理的相對酶活＜80%，而其他金屬離子對酶活無顯著的促進或抑制作用（P＞0.05）。

圖6 金屬離子及化合物對菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ions on the activity and stability of chitinase produced by strain RGZ2-4-5

本研究菌株RGZ2-4-5產生的幾丁質酶最適反應溫度為50 ℃，低于RAY L等[3，15]報道的耐熱幾丁質酶，高于國內報道的海洋菌產幾丁質酶的結果[21-22]。幾丁質酶的最適反應pH多為7.0左右[3，10，22]，菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶的最適pH為5.0，在pH5.0～7.0的范圍內穩定性均在70%以上，寬泛的反應溫度范圍和酸堿適應范圍使其有利于在工業發酵中應用。

2.4 菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶對幾丁質降解產物分析

采用TLC分析菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶對幾丁質的降解產物，結果見圖7。

圖7 菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶對幾丁質的降解產物的分析結果Fig.7 Analysis results of chitin degradation products by chitinase produced by strain RGZ2-4-5

由圖7可知，該菌株所產幾丁質酶可水解幾丁質，主要產物為幾丁二糖[（GlcNAc）2]，還有少量的幾丁單糖（GlcNAc）和幾丁三糖。不同溫度處理的產物量有所不同，在30～50 ℃范圍內，隨著溫度的增加，幾丁三糖含量從少量到幾乎不產，然而幾丁單糖和幾丁二糖含量有所增加，在50 ℃時達到最高。分析原因可能是在最適反應溫度下，底物充分水解，因此單糖和二糖產量高，60 ℃酶活力迅速減弱，反應最終產物只有少量的幾丁二糖。

內切幾丁質酶（EC 3.2.1.14）從幾丁質多糖鏈的內部隨機水解幾丁質，生成幾丁寡糖（（GlcNAc）n，n＞2），幾丁質先是被降解成分子質量不一的寡糖，隨著時間的延長，最終被水解成（G1cNAc）2及少量的GlcNAc[12，26]。根據水解產物判斷菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶為內切幾丁質酶。在最適反應溫度下，酶能更充分的分解底物，最終產物為（GlcNAc）2和少量的GlcNAc。

3 結論

本研究采用透明圈法和酶活力測定從西藏日喀則土壤樣品中篩選獲得的一株高產幾丁質酶的菌株RGZ2-4-5，其在以1%膠體幾丁質作為唯一碳、氮源條件下發酵，幾丁質酶活力達到242.36 U/mL。通過形態觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析鑒定該菌株為Massilia aquatica。菌株RGZ2-4-5所產幾丁質酶的最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為5.0，在溫度30～40 ℃，pH 5.0～7.0的條件下粗酶液具有較好的穩定性，金屬離子Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cr2+、Ag+、Co2+、PMSF對幾丁質酶活具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。TLC結果顯示，該酶水解幾丁質的最終產物為（GlcNAc）2和GlcNAc。