老陳醋醋酸發酵不同翻醅方式醋醅特性的動態變化分析

申 瑾，夏瑤瑤，梁 楷，周景麗，閆裕峰*，趙慧姿，李 杰

（1.食醋發酵科學與工程山西省重點實驗室，山西 太原 030400；2.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030400）

老陳醋手工醋酸發酵工藝采用陶缸發酵，產品風味好、營養豐富[1-2]，但其生產過程的控制主要依靠老師傅多年的經驗和直觀感覺，存在釀造過程難以實現標準化、生產效率低、勞動強度大等缺陷。在保證老陳醋優良品質的前提下，機械化固態醋酸發酵工藝可實現老陳醋的標準化生產，提高生產效率和產品品質。老陳醋機械化固態醋酸發酵利用拌醅機將酒精發酵結束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合，隨后接入含有大量生長于對數期的醋酸菌的火醅進行醋酸發酵，每日翻醅利用翻倒醅機代替手工翻醅和倒缸[3]。利用機械化設備對手工釀造工藝進行升級可實現老陳醋的標準化生產，進而提高山西食醋行業科技水平和市場競爭力，對于老陳醋手工釀造技藝非遺的傳承和弘揚也具有重要意義。

食醋醋酸發酵過程中內在特性的研究集中于微生物菌群、理化指標及風味物質的變化分析。于華等[4]對四川麩醋發酵過程中醋醅理化指標及有機酸變化進行研究發現，揮發酸、不揮發酸與總酸變化趨勢大致相同；氨基酸態氮含量呈先快后慢的上升趨勢；還原糖含量先升高后降低。從醋醅樣品中共檢測出8種有機酸，其中乙酸和乳酸為主體有機酸。KOU R等[5]通過Illumina Hiseq測序發現，山西老陳醋醋酸發酵過程中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是山西陳醋夏季發酵過程中的兩個主要類群，它們分別在乙酸發酵和酒精發酵階段占主導地位。鄭宇等[6]對中國手工固態發酵食醋主要特征風味物質組成進行分析，發現乙酸和乳酸是手工食醋中含量最高且風味貢獻最大的主體有機酸，其含量占總有機酸含量的80%以上。王超等[7]對鎮江香醋醋酸發酵過程中理化指標的動態進行研究發現，水分含量變化不顯著，還原糖呈先增后減趨勢，pH值和蛋白質呈下降趨勢，總酸、氨基酸和銨鹽呈遞增趨勢。陳旭峰等[8]對山西老陳醋釀造過程中理化指標及風味物質進行研究發現，醋酸發酵階段酸度和有機酸含量不斷增長，還原糖和氨基酸態氮的含量先上升后下降。目前，醋酸發酵不同翻醅方式對老陳醋品質影響的研究報道尚鮮見。

本研究采用手工及機械翻醅方式，對老陳醋醋酸發酵過程中理化指標、有機酸及香氣成分進行跟蹤測定，比較兩種醋酸發酵翻醅方式對老陳醋品質的影響，以期掌握老陳醋手工及機械翻醅方式下醋酸發酵的內在特性和變化規律，為老陳醋醋酸發酵工藝的優化提供一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 醋醅樣品

醋醅樣品：采集山西紫林醋業股份有限公司。老陳醋醋酸發酵手工翻醅方式采樣點（0、2 d、6 d、10 d）與機械翻醅方式采樣點（0、2 d、8 d、12 d、14 d）。機械翻醅發酵時間為14 d結束，手工翻醅為10 d結束。

1.1.2 化學試劑

硫酸銅、亞甲基藍（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；蘆丁（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；酒石酸、乳酸、草酸、檸檬酸、丙酮酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸（均為色譜純）：天津市光復精細化工研究所。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、MRS培養基、孟加拉紅培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

STARTER 3100 pH計、AR124CN電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4型水浴鍋：常州榮華儀器制造有限公司；T3202分光光度計：太原市瑞佳科學器材有限公司；WGZ-800濁度計：上海昕瑞儀器儀表有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配紫外檢測器）、7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、7000D型氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司；FPJ1500翻醅機：溫州市伯泰機械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 老陳醋醋酸發酵翻醅方式

手工翻醅：老陳醋固態醋酸發酵利用拌醅機將酒精發酵結束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合，隨后接入含有大量生長于對數期的醋酸菌的火醅進行醋酸發酵，每日翻醅工人進行手工翻醅和倒缸。

機械翻醅：老陳醋機械化固態醋酸發酵利用拌醅機將酒精發酵結束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合，隨后接入含有大量生長于對數期的醋酸菌的火醅進行醋酸發酵，每日翻醅利用翻醅機代替手工翻醅和倒缸。

1.3.2 理化指標的測定

總酸、不揮發酸、還原糖、氨基酸態氮、pH值：參照國標GB/T 19777—2013《地理標志產品山西老陳醋》中的方法進行測定[9]。

1.3.3 有機酸含量的測定

有機酸含量的測定采用高效液相色譜法[10]。

前處理方法：取2 mL待測樣品，加2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀和2 mL 30%硫酸鋅溶液，用蒸餾水稀釋定容到25 mL，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，備用。

高效液相色譜條件：SinochromODS-BP色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.01 mmol/L KH2PO4（用磷酸調pH=2.7）∶甲醇=97∶3（V/V）；流速0.6mL/min；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

定性與定量分析：將乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸7種標準品儲備液稀釋成不同濃度混合溶液后進行色譜分離，各有機酸的出峰保留時間用于有機酸的定性分析。以色譜峰面積對各標準有機酸的標準溶液濃度進行線性回歸分析，各有機酸標準曲線線性相關系數為0.997 2～0.999 3，按照各有機酸標準曲線回歸方程計算醋樣中有機酸的含量。

1.3.4 香氣成分的測定

香氣成分的測定采用頂空固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用法[11-13]。

前處理方法：先將萃取頭在氣相色譜的進樣口于250 ℃老化至無雜峰，將6 mL醋樣放入15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入1.5 g固體氯化鈉，加蓋。放入40 ℃恒溫水浴中，將SPME萃取頭通過瓶蓋插入到樣品中的頂空部分，推出纖維頭，頂空吸附40 min，隨后抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭插入氣相色譜-質譜儀的氣相色譜進樣口，推出纖維頭，于250 ℃解吸3 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數據。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣（He），流量0.9 mL/min；進樣口溫度250 ℃，不分流；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持6 min，以3 ℃/min升溫至90 ℃，保持2.5 min，以10 ℃/min升溫至100 ℃，保持4 min，以3 ℃/min升溫至220 ℃，再以40 ℃/min升溫至270 ℃，保持10 min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質量范圍33～450 amu。

定性與定量分析：香氣成分的定性以美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17譜庫和人工圖譜解析共同確定，選取匹配度＞70%的化合物為有效香氣成分。各香氣成分的定量采用峰面積歸一化法。

2 結果與分析

2.1 老陳醋不同翻醅方式醋酸發酵過程中理化指標的動態變化

2.1.1 總酸含量和pH值

醋醅總酸的變化主要是醋醅中乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、丁酸、己酸等含量的改變引起的，是評價醋酸發酵過程的決定性指標[14]。手工和機械翻醅醋酸發酵過程總酸含量和pH的變化見圖1。

圖1 手工和機械翻醅醋酸發酵過程總酸含量和pH的變化Fig.1 Changes of total acid contents and pH during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

由圖1可知，手工和機械翻醅醋酸發酵過程醋醅的總酸均呈上升趨勢，手工翻醅總酸上升更快，但前2 d平均增長速度最快，這可能是前期的醋醅適宜產酸微生物的生長繁殖及代謝，進而有機酸大量生成，使總酸含量迅速升高；醋酸發酵2 d之后，手工和機械翻醅醋酸發酵總酸繼續上升，而機械翻醅總酸上升速度較手工翻醅慢；到發酵后期，由于營養物質的消耗和有機酸的積累，使釀造環境處于高酸度、低營養狀態，導致醋酸菌、乳酸菌等產酸菌代謝緩慢，總酸含量增長速度減緩。隨著總酸含量的增加，pH值逐漸降低，但變化幅度很小，pH均只下降了0.3。手工和機械翻醅醋酸發酵過程pH值始終維持在3.7～4.0之間，說明兩種工藝在醋酸發酵過程中形成了一個緩沖體系，pH值始終處于動態平衡，這與于華等[4]的研究結果一致。整體來看，與手工相比，機械翻醅降低了人力勞動，總酸含量較低于手工翻醅，pH值變化不大。

2.1.2 不揮發酸含量的變化

不揮發酸是形成老陳醋風味的基本骨架[15]。老陳醋中含有豐富的不揮發酸，如乳酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸等，不揮發酸可緩沖乙酸的刺激性，使食醋酸味柔和醇厚[16-17]。手工和機械翻醅醋酸發酵過程不揮發酸含量的變化見圖2。由圖2可知，手工和機械翻醅醋酸發酵過程醋醅的不揮發酸均呈現先增加再趨于平穩的變化趨勢。發酵前2 d醋醅的不揮發酸急劇增加，可能是發酵初期醋醅接火后醋醅并未整體翻動，大部分醋醅處于厭氧狀態，乳酸菌發酵產生乳酸。醋酸發酵2 d之后，不揮發酸基本趨于穩定，而機械翻醅不揮發酸含量有下降趨勢，到發酵結束手工和機械翻醅醋酸發酵過程醋醅的不揮發酸基本一致。不揮發酸含量的下降可能是由于有機酸與醇類物質發生酯化反應造成的，也可能是由于醋酸菌大量繁殖，乳酸被分解所致。

圖2 手工和機械翻醅醋酸發酵過程不揮發酸含量的變化Fig.2 Changes of non-volatile acid contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

2.1.3 氨基酸態氮含量的變化

氨基酸態氮是食醋重要的組成部分，反映食醋中氨基酸及小肽總體水平，其含量的高低影響著食醋的質量等級和整體風味[18-19]。手工和機械翻醅醋酸發酵過程氨基酸態氮含量的變化見圖3。由圖3可知，手工和機械工藝醋酸發酵過程中醋醅的氨基酸態氮含量均呈上升趨勢，發酵前期增長速度快，發酵后期氨基酸態氮的增長幅度變緩。發酵前2 d氨基酸態氮的含量急劇增加，機械翻醅速度高于手工翻醅速度，可能是發酵前期微生物代謝產生大量酶類，原料中的蛋白質在蛋白酶的作用下分解成多肽，多肽又經肽酶作用形成氨基酸，也可能與酒精發酵結束酒醪中酵母的自溶及酒醪中酸性蛋白酶的水解有關[20]。醋酸發酵2 d之后，氨基酸態氮含量呈上升趨勢。發酵后期氨基酸態氮增長幅度變緩，可能是醋酸發酵后期醋醅總酸的增加影響了蛋白酶的活性。

圖3 手工和機械翻醅醋酸發酵過程氨基酸態氮含量的變化Fig.3 Changes of amino acid nitrogen contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

2.1.4 還原糖含量的變化

食醋中的還原糖主要是葡萄糖和麥芽糖，原料糖化、酒化后，殘余的糖大部分被醋酸菌所利用，余下的小部分保留在最后的食醋產品中，起到調節食醋風味的作用[21-22]。手工和機械翻醅醋酸發酵過程還原糖含量的變化見圖4。由圖4可知，手工和機械工藝醋酸發酵過程中還原糖含量均呈現先增加后減小的趨勢。醋酸發酵過程是一個以醋酸菌發酵為主，多菌種共同參與的過程，發酵前期醋酸菌還未成為優勢菌，麩皮等輔料中的淀粉被分解為還原糖，因此發酵初期前2 d還原糖含量呈現上升趨勢；醋酸發酵2 d之后，還原糖含量整體呈下降趨勢。當醋酸菌成為發酵的優勢菌種后，醋酸菌大量繁殖，葡萄糖作為醋酸菌的碳源而被利用，因此后期還原糖呈現下降趨勢。

圖4 手工和機械翻醅醋酸發酵過程還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

2.2 老陳醋不同翻醅方式醋酸發酵過程中有機酸含量的變化

兩種翻醅方式下7種有機酸含量測定結果分別見表1與表2。

表1 手工翻醅醋酸發酵過程有機酸含量的變化Table 1 Changes of organic acid contents during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains

表2 機械翻醅醋酸發酵過程有機酸含量的變化Table 2 Changes of organic acid contents during acetic acid fermentation process by mechanical turning fermented grains

由表1和表2可知，兩種翻醅方式醋酸發酵過程中的主體有機酸均為乙酸和乳酸，其含量在總有機酸中所占比例高達85%以上。乳酸是主要的非揮發性酸，可以減輕醋的刺激性味道并改善風味[23-24]，所以醋酸和乳酸的比例對食醋風味品質很重要[25]。隨著醋酸發酵的進行，兩種操作方式醋醅中的乙酸均呈上升趨勢，乳酸均呈下降趨勢，醋酸發酵結束后兩種操作方式醋醅中，手工翻醅乙酸和乳酸含量在總有機酸中所占比例為93%，機械翻醅乙酸和乳酸含量在總有機酸中所占比例約為92%；兩種操作方式醋酸發酵過程琥珀酸呈下降趨勢。手工翻醅過程中，甲酸基本呈上升趨勢而機械翻醅變化趨勢正好相反，α-酮戊二酸呈下降趨勢，檸檬酸呈上升趨勢而機械翻醅變化趨勢正好相反。

2.3 老陳醋不同翻醅方式醋酸發酵過程中香氣成分的變化

采用頂空固相微萃取結合氣質聯用技術，對手工和機械翻醅醋酸發酵過程中的香氣成分進行檢測，結果分別見表3與表4。由表3可知，手工翻醅醋酸發酵階段共檢出33種香氣成分，包括4種醇類、4種酸類、8種酯類、6種醛類、4種雜環類和7種其他類。由表4可知，機械翻醅醋酸發酵階段共檢出35種香氣成分，包括7種醇類、4種酸類、8種酯類、1種酮類、5種醛類、2種雜環類和8種其他類。兩種操作方式醋酸發酵階段的香氣成分均以醇類、酸類、酯類為主。兩種操作方式醋酸發酵初期醇類均為主體香氣成分，隨著發酵的進行，醇類物質的含量大幅降低；兩種操作方式的酸類物質在醋酸發酵過程中均呈現上升趨勢，醋酸發酵結束后酸類物質成為主體香氣成分，手工翻醅的酸類物質相對占比高于機械翻醅。兩種操作方式的酯類物質在醋酸發酵過程中均呈現上升趨勢，醋酸發酵結束后手工操作方式的酯類物質相對占比低于機械操作方式。

表3 手工翻醅醋酸發酵過程香氣成分的變化Table 3 Changes of aroma components during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains

表4 機械翻醅醋酸發酵過程香氣成分的變化Table 4 Change of aroma components during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains

3 結論

本研究對老陳醋手工與機械翻醅醋酸發酵過程中的理化指標、有機酸及香氣成分進行檢測分析，結果表明，兩種操作方式在醋酸發酵過程中總酸、不揮發酸、氨基酸態氮含量均呈上升趨勢，pH值的變化幅度很小，始終維持在3.7～4.0之間，還原糖呈先上升后下降的趨勢；乳酸和乙酸為醋酸發酵過程中的主體有機酸，二者占有機酸總量的85%以上，在醋酸發酵過程中兩種操作方式的乙酸均呈上升趨勢，乳酸均呈下降趨勢，其他5種有機酸的變化趨勢有一定的差異，兩種操作方式醋酸發酵階段檢測出的香氣成分總數相差不大，但種類有一定的差異。手工翻醅醋酸發酵階段共檢出33種香氣成分，包括4種醇類、4種酸類、8種酯類、6種醛類、4種雜環類和7種其他類。機械翻醅醋酸發酵階段共檢出35種香氣成分，包括7種醇類、4種酸類、8種酯類、1種酮類、5種醛類、2種雜環類和8種其他類。兩種操作方式醋酸發酵階段香氣成分的組成均以酸類、醇類、酯類為主，機械翻醅醋醅風味較優于手工翻醅。