11種國產高鹽稀態醬油的氨基酸組分和揮發性物質的特征性分析

戴璐瑤，許睿琦，蘇志林，陳書婧，吳昊霖，吳劍榮*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

醬油是我國傳統的發酵食品，我國生產醬油的歷史已長達兩千多年[1]，如今傳統醬油的生產工藝和原料受到歷史發展[2]、地理條件以及飲食習慣的影響，已經具有明顯的地域差異[3]，不同地區逐漸形成獨具特色的流派[4-7]。廣式醬油起源于以廣東為主的珠江三角洲地區[8]，是中國傳統釀造醬油的一個重要流派[9]。現代廣式高鹽稀態醬油在日式醬油生產技術基礎上進行創新，以大豆和小麥粉為主要原料，采用大型圓盤制曲、深層稀醪發酵和壓榨提取與滅菌等工藝[4，10]。在發酵和陳化過程中，原料中的蛋白質降解為谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸，而多糖降解為葡萄糖等單糖，進而影響醬油的風味和口感[11]。

風味品質對消費者的接受度和偏好性起著至關重要的作用，風味主要是由產品的香味和滋味特征決定的，與醬油中的揮發性化合物和氨基酸有關[12]。醬油發酵過程中，微生物所分泌的酶催化蛋白質水解產生的氨基酸是醬油的重要組成部分[13]，是評價我國醬油質量等級的重要指標，具有改善醬油口感和功能的作用。醬油中的揮發性香氣成分是決定其質量的關鍵指標之一[10]，醇、酯、酸、酚、醛、酮、吡嗪、呋喃等香氣物質使得醬油具有獨特的風味體系和調味效果[14]。醬油中的揮發性物質品目繁多，呈香機制錯綜復雜，大部分揮發性成分在醬油中的含量極低，但由于其閾值較低，對醬油的風味具有極其重要的貢獻作用[11]。

得益于珠三角的充足陽光和高溫，所釀制醬油因其醬香、豉香濃郁，風味獨特，越來越受到消費者的青睞[15]。而我國其他不同省市也有企業采用高鹽稀態釀造醬油工藝，由于緯度高，主要采用類似日式工藝，這些不同地區的高鹽稀態醬油在風味品質方面存在一定區別[16]。目前對不同類型的醬油進行分類鑒別的研究有很多，如CHEN Y Q等[17]通過9種理化指標結合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘分析等多元統計方法，對不同工藝和地域的醬油實現了鑒別；ZHU L等[18]通過紅外光譜構建醬油糖類、蛋白質和氨基酸等整體營養指紋圖譜結合偏最小二乘分析能夠快速判別不同種類的醬油；XU L B等[19]通過28種揮發性物質含量結合人工神經網絡分析對15個驗證集樣品檢驗，結果表明可根據發酵程度和地理區域成功進行分類，預測準確率為100%。

本研究以不同產地的廣式和非廣式高鹽稀態醬油為研究對象，解析高鹽稀態醬油中氨基酸組成和揮發性組分，利用偏最小二乘判別分析建立廣式醬油的產地溯源模型，確定廣式醬油的有效溯源指標。基于醬油中的揮發性組分解析高鹽稀態廣式醬油風味的獨特性，對實現廣式醬油的產品保護和區分具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11種國產高鹽稀態醬油樣品：均購自無錫市超市。其中6種非廣式醬油（NG），編號分別為S1（氨基酸態氮≥1.1 g/100 mL）、S2～S5（氨基酸態氮≥1.2 g/100 mL）、S6（氨基酸態氮≥0.7 g/100 mL）；5種廣式醬油（G），編號為S7（氨基酸態氮≥1.25 g/100 mL）、S8～S10（氨基酸態氮≥1.0 g/100 mL）、S11（氨基酸態氮≥1.2 g/100 mL）。

萬字烹調用濃口醬油（特級，氨基酸態氮≥0.80g/100mL）：日本龜甲萬株式會社；萬字純釀造醬油（特級，氨基酸態氮≥0.80 g/100 mL）：昆山統萬微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Agilent Hypersil ODS色譜柱：美國Agilent公司；TSQ8000三重四級桿氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 醬油中氨基酸的測定

樣品預處理：用三氯醋酸（trichloroacetic acid，TCA）稀釋醬油樣品，使稀釋液中TCA終含量為5%，靜置3 h后用濾紙過濾，取1 mL濾液于1.5 mL離心管中，在15 000 r/min離心30 min，取上清，過0.22 μm水膜，裝入液相瓶中用于檢測。

HPLC條件：Agilent Hypersil ODS色譜柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）；樣品檢測采用OPA-FMOC柱前衍生。流動相A和流動相B配制參考文獻[20]的方法。采用梯度洗脫，流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；紫外檢測波長：338 nm，脯氨酸在波長262 nm處檢測；氨基酸根據保留時間進行定性，含量以外標法定量。

1.3.2 揮發性組分的檢測

樣品前處理：稱取5.00 g樣品于15 mL樣品瓶中，添加10 μL的2-辛醇（50 mg/L）作為內標，加蓋密封待檢。在60 ℃恒溫預熱15 min。將CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶萃取30 min，萃取后再插入進樣口，解吸4 min。

氣相色譜條件：TG-WAXMS A石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序為起始柱溫40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至230 ℃，保持8 min。載氣為高純氦氣（He），恒流模式，流速1.2 mL/min，進樣溫度270 ℃。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；質譜掃描范圍45～400 amu；質譜接口溫度200 ℃，采用不分流模式。

定性定量方法：質譜數據與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）標準譜庫2014進行比對鑒定，再結合相同分析條件下正構烷烴標準品的出峰情況計算出各個峰的相對保留指數，與文獻報道的保留指數對比綜合定性。使用Xcalibur軟件對GC-MS的結果進行處理，各揮發性化合物的相對含量采用峰面積歸一法計算。

1.3.3 數據處理每個樣品做3個平行，結果取平均值，采用Origin 2020軟件進行繪圖析。醬油中氨基酸特征采用稀疏偏最小二乘-判別分析（sparse partial least squares-discriminant analysis，sPLS-DA）模型進行分析。GC-MS測定結果用SIMCA 14.0對樣品中揮發性成分的相對含量進行偏最小二乘-判別分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）分析。

2 結果與分析

2.1 高鹽稀態醬油的氨基酸的特征性分析

2.1.1 高鹽稀態醬油的氨基酸含量與組成

生產醬油原料中的蛋白質逐漸水解成的多肽和氨基酸，慢慢形成醬油特有的風味和口感[21]。在評估食品的營養價值時，氨基酸在食品中占有舉足輕重的地位[22]。不同食物蛋白的氨基酸組成比例不同，其營養價值的高低與所含的氨基酸種類、必需氨基酸的含量及比例等因素有關[23]。利用高效液相色譜法檢測11個不同品牌高鹽稀態醬油的氨基酸含量，結果見表1。

表1 不同醬油樣品中的游離氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents in different soy sauce samples mg/mL

由表1可知，同一樣品中不同氨基酸的含量差異巨大。根據氨基酸總含量排序，不同品牌醬油樣品依次是S5＞S3＞S7＞S9＞S4＞S2＞S10＞S11＞S1＞S8＞S6，其含量為55.86～121.06 mg/mL。

一般來說，根據發酵醬油的生產工藝，谷氨酸占總氨基酸的比例約為18%～25%[24]，但在所有樣品中，谷氨酸的比例超過30%，故而認為所有樣品均加入增鮮劑谷氨酸鈉。排除谷氨酸的影響后，所有樣品中16種不同氨基酸占總氨基酸的比例見圖1。

圖1 不同醬油樣品中游離氨基酸占總氨基酸含量的比例Fig.1 Ratio of free amino acids and total amino acids in different soy sauce samples

由圖1可知，不同醬油樣品的游離氨基酸比例有所差異，Asp、Leu、Ala比例最高，占7%～15%；Ser、Val、Ile、Phe、Lys和Pro比例較高，占6%～8%；Gly、Thr次之，占4%～6%；Tyr、Met、His、Arg比例最低，約為1%～3%；His、Gly、Thr、Phe、Ser、Met、Ala、Lyr、Val、Glu等氨基酸在廣式醬油和非廣式醬油之間有明顯差異。

2.1.2 醬油中必需氨基酸的分析

必需氨基酸是衡量人類膳食蛋白質品質的重要指標，醬油中含有構成人體蛋白質的所有必需氨基酸[25]，這表明醬油是人類攝取必需氨基酸的重要飲食途經。由于HPLC無法定量色氨酸，所以僅評價其余7種必需氨基酸對醬油的營養價值。由表2可知，S1樣品含量最高（28.61 mg/mL），S9樣品含量最低（11.59 mg/mL）。聯合國糧食及農業組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界衛生組織（world health organization，WHO）以人體不同必需氨基酸的含量為參考，規定攝入人體的蛋白質中必需氨基酸占總氨基酸40%，必需氨基酸占非必需氨基酸60%[26]，它是優質蛋白質中氨基酸的理想配比。在本研究采集的樣品中，前者的比例為11.00%～32.52%，后者的比例為12.36%～48.19%，S1醬油樣品的氨基酸比例最接近這兩個數值，說明其營養價值在所有樣品中最高。按照FAO/WHO對必需氨基酸的含量對不同品牌醬油樣品質量進行排序，從高到低依次為S1＞S6＞S4＞S2＞S11＞S8＞S10＞S7＞S3＞S5＞S9。不同品牌醬油中7種必需氨基酸占總氨基酸的百分比見表2。

由表2可知，11種醬油樣品中絕大多數樣品必需氨基酸的比例不能達到WHO/FAO標準譜規定的含量，尤其是Met的含量（0.60%～1.67%）遠遠低于規定的3.5%，說明醬油中Met的含量普遍較低。S1樣品中的必需氨基酸含量最高，Thr、Lys的含量接近WHO/FAO標準，而Val、Ile、Leu的含量滿足WHO/FAO標準，說明其氨基酸營養價值明顯優于其他樣品，進一步證明了醬油S1的質量較高。

2.1.3 醬油中呈味氨基酸的分析

不同品牌醬油滋味的差別取決于其所含的各種呈味氨基酸，醬油風味的優劣取決于呈味氨基酸的含量和比例。根據味道的差異可以將氨基酸分為鮮味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基酸（Gly、Ala、Ser、Pro、Thr）和苦味氨基酸（Tyr、Phe、Val、Leu）[23]。不同醬油中呈味氨基酸的測定結果見表3。由表3可知，在醬油中呈味氨基酸的含量從大到小依次為鮮味類、甜味類和苦味類。鮮味氨基酸的含量最高，11種樣品里的含量均在42%以上，因而對醬油的風味貢獻也最大，其中Glu含量最高，為33.65%～78.39%；甜味氨基酸的含量次之，為9.28%～23.50%；苦味氨基酸的含量最低，為5.77%～18.14%。其中，Phe和Tyr具有特殊的香氣，能夠為醬油提供特殊風味。通過分析能夠得出醬油的滋味以鮮味氨基酸為主，甜味氨基酸為輔，而醬油的香味則與芳香族氨基酸Phe和Tyr有關，醬油鮮美的滋味與醇厚的香味與這些呈味氨基酸密切相關。

2.1.4 基于氨基酸成分建立不同產地醬油sPLS-DA辨別模型

使用稀疏PLS-DA（sPLS-DA）算法可用于有效減少高維代謝組學數據中的變量（代謝物）數量，以產生穩健且易于解釋的模型，可以通過控制模型中的組分數量和每個組分中的變量數量來控制模型的稀疏程度。先對各個氨基酸根據sPLS解釋成分方差分析，結果見圖2。由圖2可知，成分1（Phe、Gly、Ser、Ala、Val、Tyr、Met、T、Glu、Thr等氨基酸有較大的權重）方差為18.3%，成分2（Gly、Val、Tyr、E、Lys、Arg等氨基酸有顯著的權重）方差為15.9%，成分3（和E/T有關）方差21.4%，成分4（和E/N有關）方差17%，成分5（與Gly、A以及E/T、E/N有關的氨基酸有顯著關聯性）方差14.4%。各個主成分的含量集中在20%左右（14.4%～21.4%），較為均衡，所以模型可信度較高，主成分降維效果較好。

圖2 稀疏偏最小二乘法-判別分析解釋成分方差分析Fig.2 Variance analysis of sparse partial least squares-discriminant analysis interpretive component

以這幾個主成分來對醬油進行分類，結果見圖3。由圖3可知，95%置信區間重疊較小，對11個樣品進行非廣式與廣式區分效果較好。廣式醬油的發酵過程比非廣式醬油的發酵過程復雜，經歷陽光房曝曬過程，從而確保氨基酸的完整性和多樣性；非廣式醬油的較高緯度和陽光照射強度低等因素可能導致了兩種醬油成分出現較大差異。

圖3 稀疏偏最小二乘法-判別分析二維得分圖Fig.3 Two-dimensional score diagram of sparse partial least squares-discriminant analysis

sPLS-DA模型為特定成分選擇的變量圖見圖4。變量是按其負荷的絕對值排列的。使用交叉驗證（cross variation，CV）評估的sPLS-DA模型的性能圖，使用指定數量的變量創建的成分數量增加。

圖4 交叉驗證模型載荷（a）和稀疏偏最小二乘法-判別分析分類誤差率（b）Fig.4 Cross-validate model load(a)and sparse partial least squaresdiscriminant analysis classification error rate (b)

由圖4可知，以成分1、2、3、5作為劃分廣式、非廣式的依據誤差率均為45.5%，以成分4劃分誤差率為36.4%。廣式醬油中苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸含量較低，非廣式醬油中甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、谷氨酸、蘇氨酸含量較低[27]。

2.2 基于揮發性物質建立不同產地醬油PLS-DA判別模型

進一步對不同品牌醬油中的揮發性物質含量進行偏最小二乘判別分析，以探究廣式醬油與非廣式醬油揮發性成分的差異。在11種醬油樣品中共檢測到240種揮發性物質，通過過濾50%以上的樣品中都沒有檢測到的揮發性物質一共得到91種揮發性物質，結果見表4。

表4 不同醬油樣品中揮發性成分含量Table 4 Volatile components contents in different soy sauce samples%

將廣式醬油與非廣式醬油的11個樣品得到的揮發性物質進行有監督的偏最小二乘判別分析。以表4中的91種揮發性物質含量為X變量，以樣品的種類為Y變量，對樣本進行PLS-DA分析，構建溯源模型。PLS-DA模型中，該模型中R2X和R2Y分別表示在X軸方向和Y軸方向上對變量的解釋能力，Q2表示模型對分組的預測能力[22]，該模型中R2X、R2Y和Q2分別為0.443、0.932、0.666，說明建立的PLS-DA模型能有效解釋廣式醬油不同產區之間的差異，且該模型的產地識別預測精度可達到93.2%。PLS-DA模型第1、第2主成分得分圖見圖5。

圖5 基于揮發性物質不同醬油樣品偏最小二乘法-判別分析模型得分圖Fig.5 Score plot of partial least squares-discriminant analysis model of different soy sauce samples based on volatile components

由圖5可知，廣式醬油與非廣式醬油樣本完全分離，分類效果好。PLS-DA模型載荷圖見圖6。

圖6 基于揮發性物質不同醬油樣品偏最小二乘法-判別分析模型載荷散點圖Fig.6 Loading scatter plot of partial least squares-discriminant analysis model of different soy sauce samples based on volatile components

由圖6可知，C8（2,6-二甲基吡嗪）、C49（甲醇）、C64（呋喃）、C44（辛乙烯二醇單正十二烷基酯）、C1（山梨酸）、C36（2-丁酮）、C7（鄰甲氧基苯酚）與廣式醬油相關性較高。C87（（2R,3R）-2,3-丁二醇）、C39（2,3,5,6-四甲基吡嗪）與非廣式醬油相關性較高。

變量重要性投影（variable important in the projection，VIP）值能夠量化PLS-DA的各個變量（X變量）對樣品分類判別（Y變量）的貢獻程度，VIP＞1的變量被認為是貢獻較大的變量[28]。由圖7可知，PLS-DA的VIP得分有36個變量的VIP值＞1，其中C82（十二烷）、C8（2,6-二甲基吡嗪）、C48（辛酸乙酯）、C36（2-丁酮）、C39（2,3,5,6-四甲基吡嗪）、C7（鄰甲氧基苯酚）、C1（山梨酸）、C47（5-甲基-2-己酮）、C49（甲醇）、C88（十八酸乙酯）、C87（（2R,3R）-2,3-丁二醇）是對樣品分類有較大貢獻的物質（VIP＞1.5），說明這11種物質是區別廣式醬油與非廣式醬油的重要揮發性成分。

圖7 偏最小二乘法-判別分析模型的變量重要性投影值Fig.7 Variable important in projection values of partial least squares-discriminant analysis model

從上述分析結果來看，兩個模型都能較好區分國內的廣式醬油和非廣式醬油。目前國內非廣式醬油大多采用類似日本龜甲萬公司的醬油工藝，即在深層發酵時就加入酵母菌以產生較多風味。分別測試兩種龜甲萬醬油（日本進口和蘇州龜甲萬）的特征風味參數，發現龜甲萬醬油中乙醇含量較高。另外，兩種龜甲萬醬油中乙酸乙酯、異戊醇、苯乙醇、4-乙基愈創木酚等含量較高，而龜甲萬醬油中2,3-丁二醇和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量很低，與國產非廣式醬油的揮發性組成特征不太一致。

3 結論

本研究分析了11種國產高鹽稀態醬油中的17種氨基酸含量（不計谷氨酸含量），天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量最高，占8%～14%；醬油中鮮味類氨基酸對醬油的滋味貢獻最大。用sPLS-DA模型進行氨基酸分類辨別分析發現，苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸在非廣式中含量較高；甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸在廣式成分中占比較高。分析不同產地來源的高鹽稀態醬油揮發性成分，共檢測到91種香氣物質，采用偏最小二乘法進行判別分析，對醬油產地識別預測精度可達到93.2%。其中，2,6-二甲基吡嗪、甲醇、呋喃、辛乙烯二醇單正十二烷基酯、山梨酸、2-丁酮、鄰甲氧基苯酚等8種揮發性成分與廣式醬油相關性較高；而（2R,3R）-2,3-丁二醇和2,3,5,6-四甲基吡嗪與非廣式醬油相關性較高。