不同反芻酵母性能比較及培養條件優化

許 超，余曉斌*

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

隨著世界人口的迅速增長，人們對畜牧產品的需求也不斷增加，這就需要通過飼喂高精飼料來提高動物產量[1]，然而這容易導致動物代謝紊亂，進而產生疾病[2]。因此，有必要使用飼料添加劑來改善動物健康[3]。

在全球“禁抗”背景下，益生菌成為反芻動物營養學家和微生物學家關注的焦點。益生菌能夠改變瘤胃或后腸中的微生物種群，改變其發酵模式，并提高飼料消化率[4]。酵母作為常用的益生菌，含有多種蛋白質、氨基酸、維生素和微量元素等，營養成分十分豐富[5]。研究表明，補充酵母可以增加反芻動物的飼料攝入量和生長速度[6-7]以及改善肉奶品質等[8-9]。丁洪濤等[10]研究發現，飼糧中添加產朊假絲酵母可以提高奶牛瘤胃氨態氮和總揮發性脂肪酸含量，改善瘤胃發酵。MAAMOURI O等[11]在反芻動物飼料中添加釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）使育肥犢牛平均日質量增加400 g，極大地改善了育肥犢牛的生長性能和飼料轉化率。酵母還能通過與乳酸產生菌（如牛鏈球菌）相互競爭發酵底物，減少乳酸的產生，同時刺激乳酸利用菌（如埃氏巨型球菌和反芻獸月形單胞菌）的生長[12-13]，降低乳酸的積累，從而穩定瘤胃pH。此外，酵母還有提高免疫力[14]、改善繁殖性能[15]和清除瘤胃氧氣[16]等作用。薛帥帥等[17]研究發現，飼糧中添加布拉氏酵母可以降低犢牛血清白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，增強機體免疫功能。VILLOT C等[18]研究發現，補充1×1010CFU/d的布拉氏酵母菌可將腹瀉率從69.1%降至50.0%。因此，合理利用酵母作為飼料添加劑，對反芻動物的提質增效和健康養殖具有重要的現實意義[19]。

本研究通過對3株反芻酵母（編號分別為YL-1，YQ-1，FG-1）的耐乳酸、耐膽鹽和產氣性能進行比較，篩選出綜合性能最佳的菌株，并對篩選菌株進行鑒定。然后通過單因素試驗和響應面試驗，得到其最佳培養基配方和最適培養條件，以期為該菌株的微生態制品生產和工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種反芻酵母YL-1、AQ-1、FG-1（均已證實對反芻動物具有益生功能）：法國樂斯福公司。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD固體培養基：YPD液體培養基中添加瓊脂粉20.0 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

基礎發酵培養基：蔗糖74.0 g/L，玉米漿干粉52.0 g/L，MgSO41.1 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

乳酸、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、NaCl、CaCl2、MgSO4、MnSO4、NH4Cl、NaNO3、（NH4）2SO4（均為分析純）、魚粉蛋白胨（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；瓊脂、牛膽鹽（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；玉米漿干粉（生化試劑）：南京全隆生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GR110DR高壓蒸汽滅菌鍋：美國致微儀器有限公司；7GI-16M高速冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技公司；Synergy H4酶標儀：美國BioTek公司；SPX-250-Z恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；PHS-3C pH計：梅特勒-托利多國際股份有限公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與種子液制備

使用接種環從甘油管中蘸取少量菌液，在YPD固體培養基上劃線，然后將平板置于30 ℃的恒溫培養箱中培養48 h。挑取平板上的單菌落接種到斜面培養基培養48 h，再從斜面取一環接種至YPD液體培養基，培養12 h后得到活化的種子液。

1.3.2 菌體生物量測定

菌體密度測定：取發酵后的菌液稀釋至合適倍數，并以原始發酵培養基為空白對照，使用酶標儀測定OD560nm值。

菌落數測定：取發酵后的菌液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取0.2 mL稀釋液涂布于固體YPD平板，培養48 h后統計菌落數。

1.3.3 耐乳酸試驗

在滅菌后的YPD液體培養基中加入乳酸，分別調節pH值為3.0、4.0、5.0、6.0，然后以4%接種量接入種子液，30 ℃、180 r/min搖床培養24 h，每隔2 h取樣并測定其OD560nm值。

1.3.4 耐膽鹽試驗

將酵母種子液接種于膽鹽質量分數分別為0、0.3%、0.6%、0.9%的YPD液體培養基中，于30 ℃培養6 h，每隔2 h取樣，將樣品稀釋至合適倍數并涂布平板，30 ℃培養48 h后統計菌落數。

1.3.5 產氣試驗

取種子液50 μL接入裝有10 mL YPD液體培養基的試管中，倒置放入杜氏小管，以避免杜氏小管中產生氣泡，置于30 ℃恒溫培養箱中培養，定期觀察并記錄菌株的產氣情況。

1.3.6 菌株分子生物學鑒定

通過上述性能比較選出綜合性能最佳的菌株進行分子生物學鑒定，并作為后續試驗菌株。使用基因組提取試劑盒提取菌株全基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），并以其作為模板，利用通用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對其26S rDNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）Gen bank數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，比對結果用MEGA-X構建系統發育樹。

1.3.7 培養基配方優化單因素試驗

（1）碳源種類及最佳碳源添加量對菌株生長的影響

分別用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜和乳糖替換YPD液體培養基中的碳源，保持培養基其他組分和含量不變，按4%的接種量接種種子液，在30 ℃、180 r/min的條件下培養24 h后測定菌液OD560nm值。篩選出最適碳源后，保持其他組分不變，將其添加量設為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L，進行搖瓶培養，測定菌液的OD560nm值，以確定最佳碳源添加量。

（2）氮源種類及最佳氮源添加量對菌株生長的影響

分別用20 g/L的胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4Cl替換YPD液體培養基中的氮源，保持培養基其他組分和含量不變，培養條件和測定方法與碳源種類篩選試驗相同。篩選出最適氮源后，保持其他組分不變，將其添加量設為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L，搖瓶培養后測定菌液的OD560nm值，確定最佳氮源添加量。

（3）無機鹽種類及最佳無機鹽添加量對菌株生長的影響

分別向YPD液體培養基添加NaCl、CaCl2、K2HPO4、MgSO4和MnSO4，作為培養所需的無機鹽，添加量為1 g/L，培養基其他組分和含量保持不變，培養條件和測定方法與碳源種類篩選試驗相同。篩選出最適無機鹽后，將其添加量設為0、0.5 g/L、1.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L，保持其他組分不變，搖瓶培養后測定菌液的OD560nm值，確定最佳無機鹽添加量。

1.3.8 培養基配方優化響應面試驗[20]

根據單因素試驗結果，選取蔗糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）和MgSO4添加量（C）為考察因素，并以OD560nm值（Y）作為響應值，采用Design Expert 12.0軟件設計3因素3水平Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗因素和水平見表1。

表1 培養基配方優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for medium formula optimization

1.3.9 培養條件優化

以優化培養基為基礎，分別考察pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、培養溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）對菌液OD560nm值的影響。

1.3.10 數據分析

利用Design Expert 12.0設計Box-Behnken試驗，試驗數據采用Origin 2022繪圖。所有試驗進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 耐乳酸試驗

優良的反芻酵母應能夠在反芻動物胃腸道極端環境下存活，并與乳酸產生菌競爭發酵底物，從而穩定胃腸道pH及降低乳酸含量，因此需要對乳酸有較強耐受性。考察菌株的耐乳酸性，結果見圖1。由圖1可知，3株酵母在pH為3.0的條件下仍然能夠生長，說明3株酵母都有較強的耐乳酸能力，但菌株FG-1在pH為3.0時生長遲滯期明顯短于其余兩株酵母，說明菌株FG-1耐乳酸性能最優。

圖1 菌株AQ-1（a）、YL-1（b）、FG-1（c）的耐乳酸試驗結果Fig.1 Results of lactic acid resistance tests for strains AQ-1(a), YL-1(b) and FG-1(c)

2.2 耐膽鹽試驗

反芻酵母需要在反芻動物胃腸道內發揮其益生作用，因此必須對膽鹽等形成的高滲透壓環境有較強耐受能力。分別在膽鹽為0、0.3%、0.6%、0.9%的培養基中培養2 h、4 h、6 h，3株反芻酵母耐膽鹽試驗結果見圖2。由圖2可知，當膽鹽含量分別為0.3%和0.6%時，菌株AQ-1和YL-1的存活數與不含膽鹽相比，存活數無明顯下降，而菌株FG-1的存活數有明顯的下降；當膽鹽含量為0.9%時，3株酵母的存活數均呈下降趨勢；說明菌株AQ-1和YL-1能耐受0.6%的膽鹽含量，耐膽鹽效果較好，而菌株FG-1的膽鹽耐受力較差。

圖2 菌株AQ-1（a）、YL-1（b）、FG-1（c）耐膽鹽試驗結果Fig.2 Results of bile salt tolerance tests for strains AQ-1(a), YL-1(b) and FG-1(c)

2.3 產氣試驗

作為反芻酵母，應具備產氣量小的特點，因其產氣量大則會在反芻動物進食后引起腹脹，如瘤胃膨氣等[21]。3株酵母的產氣結果見表2。由表2可知，3株菌株均在發酵8 h后開始產氣，其中以菌株AQ-1產氣能力最強，發酵14 h產氣量便充滿整個杜氏小管，菌株YL-1產氣能力次之，于發酵16 h后產氣量充滿杜氏小管，菌株FG-1產氣能力最弱，于發酵18 h后產氣量充滿杜氏小管。說明菌株FG-1適宜作為反芻酵母飼喂反芻動物，而菌株AQ-1產氣能力過強，不適宜飼喂反芻動物。

表2 菌株產氣試驗結果Table 2 Results of gas production tests of strains

2.4 菌株分子生物學鑒定

經上述性能比較，3株菌株耐乳酸性能都比較優秀，但菌株FG-1膽鹽耐受力較差，菌株AQ-1產氣能力過強，綜合性能最佳的為菌株YL-1。對菌株YL-1進行分子生物學鑒定，利用PCR技術擴增26S rDNA，經上海生工測序，測序結果在Genbank數據庫中進行BLAST比對，將比對結果用MEGA-X軟件繪制系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株YL-1與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）MT420738聚于一個分支，親緣關系最近，在Genbank中比對的相似度也最高，相似度為100%，因此鑒定菌株YL-1為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3 基于26S rDNA基因序列菌株YL-1的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YL-1 based on 26S rDNA gene sequence

2.5 培養基配方優化單因素試驗結果

2.5.1 碳源種類及最佳碳源添加量對菌株YL-1生長的影響有機碳源是構成培養基的主要成分，對于一切異源微生物，碳源又兼做能源，是菌體生長存活必不可少的營養物質之一[22]。碳源種類及最佳碳源添加量對菌株YL-1生長的影響見圖4。由圖4a可知，當以麥芽糖作為碳源時，菌株YL-1的OD560nm值最高，蔗糖次之，這表明菌株YL-1對麥芽糖的利用效率最好，但由于麥芽糖價格昂貴，考慮到經濟因素，最終選擇蔗糖作為最適碳源。由圖4b可知，當蔗糖添加量低于70 g/L時，菌體密度隨蔗糖添加量增加而增加；當蔗糖添加量高于70 g/L時，菌體生長受到抑制；當蔗糖添加量為70 g/L時，OD560nm值最高。因此，確定最適的蔗糖添加量為70 g/L。

圖4 碳源種類（a）及蔗糖添加量（b）對菌株YL-1生長的影響Fig.4 Effects of carbon source types (a) and sucrose addition (b)on the growth of strain YL-1

2.5.2 氮源種類及最佳氮源添加量對菌株YL-1生長的影響

微生物生長和產物合成都需要利用氮源，主要用于氨基酸、蛋白質、核酸等和含氮代謝產物的合成[23]。不同氮源及最佳氮源添加量對菌株YL-1生長的影響見圖5。由圖5a可知，有機氮源的效果明顯好于無機氮源，其中以玉米漿干粉的作用效果最佳。玉米漿干粉成本低廉，且富含蛋白質、氨基酸、維生素等[24]，可以作為酵母繁殖所需的氮源。因此，選擇其作為培養基的最適氮源。由圖5b可知，隨著玉米漿干粉添加量的增加，菌株YL-1的OD560nm值呈先升高后降低的趨勢，當玉米漿干粉添加量為50 g/L時，菌株YL-1的OD560nm值最高，為4.10。因此，確定玉米漿干粉的最適添加量為50 g/L。

圖5 氮源種類（a）及玉米漿干粉添加量（b）對菌株YL-1生長的影響Fig.5 Effects of nitrogen source types (a) and corn steep power addition (b) on the growth of strain YL-1

2.5.3 無機鹽種類及最佳無機鹽添加量對菌株YL-1生長的影響

微生物的生長除了需要碳源、氮源外，還需要部分無機鹽。無機鹽的用量雖然很少，但因為其具有多種生理功能，對微生物的生長有重要影響[25]。無機鹽種類及最佳無機鹽添加量對菌株YL-1生長的影響見圖6。由圖6a可知，MgSO4作為無機鹽對菌株YL-1的菌體生長影響顯著，明顯優于其他無機鹽，而其他種類無機鹽處理與空白對照相比，對菌株YL-1的生長均有不同程度的抑制作用。因此，選擇MgSO4作為最適無機鹽。由圖6b可知，當MgSO4添加量為1 g/L時，菌株YL-1的菌體密度最高。當繼續增加MgSO4添加量，菌體密度開始緩慢下降。因此，確定MgSO4的最適添加量為1 g/L。

圖6 無機鹽種類（a）及MgSO4添加量（b）對菌株YL-1生長的影響Fig.6 Effects of inorganic salt types (a) and MgSO4 addition (b)on the growth of strain YL-1

2.6 培養基配方優化響應面試驗

2.6.1 響應面優化試驗設計及結果分析

以蔗糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）和MgSO4添加量（C）為考察因素，以OD560nm值（Y）為響應值，利用Design Expert 12.0軟件進行響應面優化設計，試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析結果見表4。

表3 培養基配方優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for medium formula optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

根據表3中的試驗結果，通過Design Expert 12.0軟件進行回歸擬合分析，得到培養基配方的二次多項回歸方程為

由表4結果可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著；失擬項的P值＞0.05，不顯著；模型的決定系數R2=0.981 5，調整決定系數R2Adj=0.957 6，均＞0.9，說明該模型擬合程度較好，可用于分析試驗結果。由回歸模型和方差分析可知，一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

2.6.2 響應面試驗結果驗證

蔗糖、玉米漿干粉和MgSO4添加量3個因素之間交互作用對菌株YL-1生長影響的響應面及等高線見圖7。

圖7 各因素間交互作用對菌株YL-1生長影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the growth of strain YL-1

由圖7可知，該方程的拋物線圖形開口均向下，說明方程存在最大值。由Design Expert12.0軟件對回歸方程求解，得到菌體密度最大時培養基最佳組合為：蔗糖添加量74.31 g/L，玉米漿干粉添加量52.38 g/L，MgSO4添加量1.12 g/L，此時菌體密度OD560nm值預測值為8.150。考慮到實際操作的可行性，將培養基組分調整為蔗糖添加量74.0 g/L，玉米漿干粉添加量52.0 g/L，MgSO4添加量1.1 g/L。在此條件下，進行3組平行驗證試驗，得到菌株YL-1的OD560nm值實際值為8.117±0.054，與預測值相差不大，說明該模型可用于預測YL-1菌體密度的變化。

2.7 菌株YL-1培養條件優化

初始pH值、培養溫度和接種量對菌株YL-1生長的影響見圖8。

圖8 初始pH值（a）、培養溫度（b）和接種量（c）對菌株YL-1生長的影響Fig.8 Effects of initial pH value (a), culture temperature (b) and inoculum (c) on the growth of strain YL-1

微生物在生長過程中都有最適pH范圍，而對于許多酵母菌而言，其最適生長pH為4.5～6.5。若pH值過高或過低，均會對酵母菌的增殖產生不利影響[26]。

由圖8a可知，當初始pH值在4.0～5.5范圍內時，菌體密度隨pH升高而增大；當初始pH值為5.5時，菌株YL-1的OD560nm值最大為8.25；當初始pH值＞5.5時，菌體密度隨pH升高而降低。因此確定最適初始pH值為5.5。溫度的變化會導致微生物生長和繁殖速度產生巨大變化。由圖8b可知，隨發酵溫度升高，菌株YL-1的OD560nm值呈先升高后下降的趨勢，在28 ℃時達到最大值，說明菌株YL-1的最適生長溫度為28 ℃。合適的接種量能夠提高發酵速度，從而縮短發酵周期，同時也有助于節約成本。由圖8c可知，當接種量為8%時，菌株YL-1的OD560nm值可達8.63，之后隨接種量增大菌體密度開始降低，說明菌株YL-1最佳接種量為8%。綜上所述，菌株YL-1的最適培養條件為初始pH值5.5，培養溫度28 ℃，接種量8%，在此最適條件下進行培養，菌株YL-1的OD560nm值可達8.835，活菌數為3.58×108CFU/mL，分別是初始培養條件下的2.38倍和2.20倍。

3 結論

本研究對3株反芻酵母的耐乳酸、耐膽鹽、產氣性能進行了比較，選出了綜合性能最佳的菌株YL-1，經分子生物學鑒定為一株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。通過單因素試驗和響應面試驗得到菌株YL-1的最佳培養基配方為蔗糖74.0 g/L，玉米漿干粉52.0 g/L，MgSO41.1 g/L。最適培養條件為初始pH值5.5，培養溫度28 ℃，接種量8%。在此優化條件下，菌株YL-1活菌數可達3.58×108CFU/mL，提高至未優化前活菌數的2.20倍。優化后的培養基采用蔗糖為主要碳源，并且采用廉價的玉米漿干粉作為氮源，培養基配方簡單，易得且成本較低，為后續反芻酵母YL-1的工業化大規模生產奠定了基礎。