李雅楠,張曉娟,董艷林,柴麗娟,陸震鳴,史勁松,許正宏*
(1.江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫 214122;3.江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫 214122;4.綠杰股份有限公司,山東 煙臺 264010)
蘋果醋是由蘋果或蘋果加工副產物經過酒精發酵和醋酸發酵兩步生產的,蘋果醋在美國、澳大利亞、法國、英國等地的食用歷史悠久,生產規模大,產品種類多,經常作為酸性調味品、飲品和家用健康輔助產品被廣泛接受[1]。蘋果醋的主體發酵代謝產物為乙酸,此外還蘋果醋中含有氨基酸類、有機酸類、酚類、黃酮類等成分,這些物質一部分來源于蘋果原料,而另一部分則是通過微生物的代謝或者由微生物中的酶催化產生的[2-3]。前期研究表明,蘋果和蘋果醋還富含酚酸類衍生物和其他類黃酮類物質[4-5],這些物質具有較強的抗氧化能力和免疫調節能力[6-8],如綠原酸、咖啡酸和兒茶素等,從而對降低血糖和血脂、治療糖尿病和減肥有積極作用[9-10]。氨基酸和有機酸是蘋果醋中重要的營養成分和調味物質,會對蘋果醋的滋味特征產生顯著影響,其中蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等非揮發性有機酸可以降低醋酸的刺激性,平衡揮發性酸和非揮發性酸的比例,使酸味更加柔和醇厚。蘋果醋的揮發性香氣成分苯乙醇、辛酸、乙酸乙酯、乙酸丁酯、異戊醇等賦予了蘋果醋花香和果香的特征[11-12]。
我國蘋果醋生產企業主要集中分布在河南、山東、河北和陜西等省[13]。但由于蘋果原料品質、發酵菌種和工藝等條件的差異,不同產地及不同企業生產的的蘋果醋在風味特性、營養特性等方面差異顯著,這些差異的本質是由于不同的蘋果醋中各類物質含量不同導致的,其中,有機酸、氨基酸和揮發性物質含量等多元的指標共同決定了蘋果醋的理化和風味特性,而總多酚和總黃酮等物質的含量指標決定了蘋果醋的抗氧化活性。研究不同來源蘋果醋的理化指標、氨基酸、有機酸、揮發性物質和抗氧化活性指標的異同,對建立蘋果醋的理化特性研究或鑒別方法具有重要意義。
該研究以來自國內外不同產地及不同企業的19份蘋果醋樣品為研究對象,測定其理化指標、氨基酸、抗氧化活性、有機酸和揮發性物質,同時對這些蘋果醋理化和風味特性的異同點進行了比較,并通過相關性分析及主成分分析對影響不同來源蘋果醋品質的特征指標進行篩選確定,為蘋果醋理化和風味品質評價提供科學依據。
1.1.1 蘋果醋樣品
采集不同來源的蘋果醋共19份,分別來自國內外不同地域及不同廠家,部分蘋果醋樣品為渾濁狀態。蘋果醋樣品編號見表1。
1.1.2 試劑
苯酚、濃硫酸、肌酸、萘酚、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、甲醇、磷酸二氫鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、蘆丁、福林酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、正丙醇氫、氧化鈉、硫酸鋅、三乙胺、四氫呋喃、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙腈(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;叔戊醇、草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、胱氨酸、精氨酸、異亮氨酸等(均為色譜純):美國Sigma Aldrich公司;乳酸、葡萄糖標準液:山東省科學院生物研究所;蒸餾水:娃哈哈公司。
酶標儀SpectraMax M2:美國Molecular Devices公司;Waters e2695高效液相色譜儀、Waters Atlantis T3(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱:美國Waters公司;5810R臺式高速冷凍離心機:Eppendorf公司;7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀:美國Agilent公司;RA-250WE 折光儀:日本京都公司;Agilent HP-5毛細管柱和萃取頭、Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent Hypersil ODS柱(250 mm×4.0 mm,5 μm):中國上海安捷倫公司。
1.3.1 理化指標測定
總酸:采用滴定法,參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》進行測定[14];有機酸:采用高效液相色譜法,參照GB/T 18623—2011《國家地理標志產品鎮江香醋》進行測定[15];可溶性固形物:采用RA-250WE 折光儀在20 ℃下測定;還原糖:按照比色法,參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》進行測定[16]。
1.3.2 總多酚含量測定
總多酚含量測定采用比色法,參考KWAW E等[17-18]的方法,取200 μL稀釋后的樣品,分別加入1.0 mL福林酚試劑,1.0 mL Na2CO3溶液,并用蒸餾水定容至4 mL,常溫避光靜置30 min,于酶標儀波長765 nm處測定吸光度值,試劑空白為參比??偠喾雍浚ㄒ詻]食子酸計)根據標準曲線方程計算總多酚含量。
1.3.3 總黃酮含量測定
總黃酮含量測定采用比色法,參考LI H C等[19]的方法,分別精密量吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL蘆丁標準液,添加0.15 mL亞硝酸鈉溶液靜置6 min,0.15 mL硝酸鋁溶液靜置6 min,2 mL NaOH溶液,最后加水定容至5 mL,振蕩混勻,靜置3 min,于酶標儀波長508 nm處測定吸光度值,根據蘆丁溶液濃度和吸光度值繪制標準曲線。取0.5 mL待測樣品,依次加入各溶液,在波長508 nm處測吸光度值,根據標準曲線回歸方程計算總黃酮含量。
1.3.4 氨基酸含量測定
將發酵液樣品12 000 r/min離心5 min獲得上清液。準確量取2 mL發酵上清液,添加2 mL 10%三氯乙酸等體積混合均勻,靜置2 h后用雙層濾紙過濾,取濾液1 mL于1.5 mL離心管內,離心后吸取上清液待分析。
采用高效液相色譜法,色譜分析條件[20-21]:色譜柱:Agilent Hypersil ODS柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);流動相:流動相A(pH=7.2):27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5),流動相B(pH=7.2):80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2);進樣體積:10 μL;流速:1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;檢測波長:發射波長340 nm、激發波長450 nm。
1.3.5 抗氧化能力檢測
亞鐵還原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)的測定:依據BENZIE I F F等[22]的方法;1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl;DPPH)自由基清除能力的測定:依據RAMIREZ J E等[23-24]的方法;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate,ABTS+)自由基清除能力測定:依據TAO Y等[25-26]的方法。
1.3.6 揮發性風味物質測定
(1)頂空固相微萃取條件
取6 mL發酵液樣品于20 mL樣品瓶中,并加入2.5 gNaCl促進揮發,加入10 μL叔戊醇(8.05 g/L)作為內標,在40 ℃儀器的加熱平臺上平衡10 min,將萃取頭插入250 ℃的GC進樣口老化30 min,然后插入已平衡好的樣品瓶中吸附。吸附完成后,插入GC進樣口,進行解吸[27]。
(2)氣相色譜-質譜條件
氣相色譜條件:Agilent HP-5毛細管柱,氦載氣流速1.2 mL/min,進樣口溫250 ℃,分流比60∶1。升溫程序為:起始溫度40 ℃,維持2 min后以3 ℃/min速率增加至130 ℃,再以6 ℃/min速率升溫至200 ℃,最后以15 ℃/min速率升溫至230 ℃,維持8 min。
質譜條件:接口溫度250 ℃,電離方式是電子電離(electron ionization,EI)源,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電子能量70 eV,捕獲方式為全掃描(25~350 m/z)[28]。
定性定量方法:對檢測出的成分采用美國國家標準技術研究所(national institute of standards and technology,NIST)11數據庫自動檢索化合物的質譜數據,參考標準光譜圖進行定性分析;采用內標法定量。
1.3.7 數據分析
采用Microsoft Excel 2010、MassHuter和SPSS 26.0進行數據處理,采用Metabo Analyst在線工具進行聚類[29]。所有檢測均進行3次重復實驗。
總酸、還原糖和可溶性固形物是食醋及蘋果醋發酵中很重要的指標,國內外蘋果醋樣品的理化指標檢測結果見圖1。

圖1 國內外蘋果醋的理化指標Fig.1 Physicochemical indexes of domestic and foreign apple cider vinegar
由圖1可知,所有蘋果醋樣品的總酸范圍在4.0~8.3 g/100 mL,國內蘋果醋樣品的總酸相對略低,但是組內的差異較大,總酸平均值在5.4 g/100 mL。國外蘋果醋作為復合調味料中一味成分的使用場景更加普遍,因此整體產品的總酸較高,總酸平均值為6.3 g/100 mL。所有蘋果醋樣品的還原糖含量范圍在2.0~12.8 g/L,國內蘋果醋樣品的還原糖含量平均值為5.3 g/L,其中部分國內蘋果醋樣品還原糖含量較高,而國外蘋果醋樣品的還原糖含量平均值為3.6 g/L??扇苄怨绦挝锖康慕Y果與還原糖結果類似,所有蘋果醋樣品可溶性固形物含量范圍在3~35°Bx,其中國內少數蘋果醋樣品可溶性固形物含量較高,最高的可以達到30°Bx以上。結果表明,蘋果醋樣品的總酸的范圍為4.0~8.3 g/100 mL,還原糖含量的范圍為2.0~12.8 g/L,可溶性固形物含量的范圍為3~35°Bx。在參試蘋果醋樣品中,國外蘋果醋樣品總酸相對較高,還原糖含量較低,國內蘋果醋樣品總酸相對較低,還原糖含量較高。
國內外19個蘋果醋樣品的抗氧化性檢測結果見圖2, 總多酚和總黃酮含量測定結果見圖3。

圖2 不同來源的蘋果醋(A)及清濁汁樣品(B)抗氧化能力分析Fig.2 Antioxidant activity of apple cider vinegar from different sources(A)and clear and turbid samples(B)

圖3 不同來源的蘋果醋總多酚(A)和總黃酮(B)含量分析Fig.3 Total polyphenols (A) and total flavones (B) contents of apple cider vinegar from different sources
由圖2A可知,整體樣品的ABTS自由基清除率呈現出跨度較大的數據分布。所有蘋果醋樣品的ABTS自由基清除率范圍是7.4%~91.0%,其中國內蘋果醋樣品的ABTS自由基清除率平均值為56%,國外蘋果醋樣品的ABTS自由基清除率平均值為41%,國內蘋果醋樣品ABTS抗氧化能力略高于國外;國內、國外樣品的DPPH自由基清除率平均值在50%以內且差異不顯著(P>0.05);所有蘋果醋樣品FRAP值范圍為0.25~2.0 mmol Trolox/L,其中國內蘋果醋樣品FRAP值平均為0.4 mmol Trolox/L,國外蘋果醋樣品FRAP值平均為0.8 mmol Trolox/L,國外蘋果醋樣品FRAP抗氧化能力略高于國內。為了具體考察未過濾樣品是否在抗氧化性質方面具有共性的特征,將未過濾的樣品歸為一組,與過濾樣品進行比較,而其他清汁蘋果醋樣品歸為一組,結果見圖2B。
由圖2B可知,濁汁蘋果醋樣品的ABTS、DPPH和FRAP抗氧化能力皆極顯著或非常顯著高于清汁樣品(P<0.01或P<0.001)。這可能是由于濁汁蘋果醋中存在的菌株或沉淀的代謝產物具有更強的抗氧化活性。
由圖3可知,國內外蘋果醋樣品的總多酚和總黃酮含量基本處于0.04~0.36 mg/mL的范圍內且差異顯著(P<0.05)。
結果表明,國內蘋果醋樣品ABTS抗氧化能力略高于國外,而國外蘋果醋樣品FRAP抗氧化能力略高于國內,濁汁蘋果醋樣品的ABTS、DPPH和FRAP抗氧化能力皆極顯著高于清汁樣品(P<0.01),所有蘋果醋樣品DPPH自由基清除率無顯著差異(P>0.05),總多酚和總黃酮含量差異顯著(P<0.05)。
對不同來源蘋果醋的氨基酸組成進行主成分分析(principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),得到的變量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值>1的氨基酸,結果見圖4和圖5。

圖4 不同來源的蘋果醋氨基酸含量分析結果(VIP>1)Fig.4 Analysis results of free amino acids in apple cider vinegar from different sources (VIP>1)

圖5 不同來源的蘋果醋氨基酸含量分析結果Fig.5 Analysis results of free amino acids in apple cider vinegar from different sources
由圖4可知,所有蘋果醋樣品的氨基酸總含量在15~300 mg/L的范圍內,其中國內樣品的氨基酸總含量(平均160.2 mg/L)較國外樣品(平均83.8 mg/L)高。從所有樣品中17種氨基酸的累積總含量的結果看,蘋果醋樣品中天冬氨酸和丙氨酸含量普遍偏高,平均含量分別為45 mg/L和28 mg/L,而半胱氨酸和絲氨酸的含量較低,平均含量分別為20 mg/L和40 mg/L。將17種氨基酸按滋味分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和無味氨基酸,大部分蘋果醋樣品中甜味氨基酸和苦味氨基酸含量較高,無味氨基酸含量最低。所有蘋果醋樣品的苦味氨基酸含量基本處于100 mg/L范圍內且含量平均值為53.96 mg/L,甜味氨基酸含量在200 mg/L范圍內且含量平均值為58.17 mg/L;無味氨基酸在6 mg/L以內且平均值為1.43 mg/L。這可能是在醋酸發酵過程中醋酸菌將蘋果汁中的天冬氨酸和谷氨酸進行了近一步的轉化,轉化趨于甜味氨基酸和苦味氨基酸方向。
由圖5A主成分分析結果可知,國內外蘋果醋樣品主體氨基酸組成有差異,經過PLS-DA分析發現,造成一些樣品之間差異的氨基酸為蛋氨酸和脯氨酸(圖5B),大多數國內蘋果醋樣品組內的氨基酸含量差異較小,國外蘋果醋樣品組內的氨基酸含量差異較大,F1、F2、F3和F4的蛋氨酸和脯氨酸含量較高,但是F5、F6、F7和F8的蛋氨酸和脯氨酸含量較低。由圖5C的主成分分析結果可知,濁汁和清汁的蘋果醋樣品的主體氨基酸組成有差異,經過PLS-DA分析谷氨酸和天冬氨酸是造成濁汁和清汁蘋果醋樣品差異的主要氨基酸(圖5D),清汁蘋果醋樣品的谷氨酸和天冬氨酸含量皆較高,而濁汁蘋果醋樣品的谷氨酸和天冬氨酸含量較低??偠灾?,蘋果醋樣品的氨基酸總含量在15~300 mg/L的范圍內,其中國內樣品的氨基酸總含量平均值相對較高。天冬氨酸和丙氨酸是蘋果醋含量較高的氨基酸,蛋氨酸和脯氨酸是部分國內外蘋果醋樣品的差異氨基酸,谷氨酸和天冬氨酸是清汁和濁汁蘋果醋樣品的差異氨基酸。
不同來源的蘋果醋有機酸含量檢測結果見圖6A,國內外醋樣以及清濁汁醋樣的PCA結果見圖6B和圖6C。

圖6 不同來源的蘋果醋有機酸含量分析結果Fig.6 Analysis results of organic acid in apple cider vinegar from different sources
由圖6A可知,國內外蘋果醋樣品的有機酸總含量基本相似,總含量大致都在20~40 g/L的范圍內,其中樣品Q8和F8的有機酸總含量最高,皆達到40 g/L左右,兩個樣品的酒石酸和乙酸含量都較其他樣品高。大多數蘋果醋樣品都含有莽草酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、奎寧酸、琥珀酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。其中,蘋果醋樣品的草酸和丙酮酸含量都在0.02~0.03 g/L左右,酒石酸和奎寧酸含量都在0.1~0.2 g/L左右,蘋果酸和乳酸的含量都在0.5~1 g/L左右,乙酸含量都在25 g/L左右,檸檬酸和琥珀酸含量都在0.1~0.4 g/L左右。綜上結果表明,乙酸是蘋果醋的主體有機酸,除了乙酸以外,蘋果醋樣品中乳酸、蘋果酸和琥珀酸的含量較高,而莽草酸和丙酮酸的含量較低。由圖6B可知,國外樣品的分布較為集中,說明國外樣品組內差異較小,有機酸的組成和含量相對較為相似,國內樣品的分布較為分散,樣品組內差異較大,有機酸的組成和部分有機酸的含量存在差異,這可能是由于不同樣品的發酵生產過程和原料不同造成的,其中乙酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸和草酸是造成差異的有機酸。由圖6C可知,濁汁蘋果醋樣品的分布較為集中,樣品組內差異較小,有機酸的組成和含量相對較為相似,而清汁的蘋果醋樣品分布較為分散,說明清汁樣品組內有機酸的組成和部分有機酸的含量存在差異,如清汁樣品之間乙酸和莽草酸的含量差別較大。綜上結果所示,在有機酸組成方面,國外蘋果醋樣品組內差異較小,國內蘋果醋樣品組內差異較大,造成差異的有機酸為乙酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸和草酸;濁汁蘋果醋樣品組內差異較小,清汁蘋果醋樣品組內差異較大,造成差異的有機酸為乙酸和莽草酸。
不同來源的蘋果醋揮發性風味物質檢測結果見圖7,國內外醋樣以及清濁汁醋樣的PCA結果見圖8。

圖7 不同來源的蘋果醋揮發性風味物質含量測定結果Fig.7 Detection results of volatile flavor compound in apple cider vinegar from different sources

圖8 不同來源的蘋果醋揮發性風味物質分析結果Fig.8 Detection results of volatile flavor compound in apple cider vinegar from different sources
由圖7可知,蘋果醋的揮發性風味物質主要檢測到醇類、酯類、酸類、酚類和醛類等物質,所有蘋果醋樣品的揮發性風味物質總含量基本相似,酸類、酯類和醇類物質占比較高。從每一類揮發性物質的所有樣品累積總含量的結果可知,酸類、酯類和醇類物質含量較高。酸類物質中乙酸、辛酸和異戊酸的含量最高,其中乙酸和異戊酸具有一定的刺激味道,而辛酸則為水果味;酯類物質中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和琥珀酸二乙酯的含量最高,乙酸乙酯可以為蘋果醋帶來一些果香風味,乙酸異戊酯則可以賦予蘋果醋香蕉般的果味;醇類物質中苯乙醇、異戊醇的含量最高,其中苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣,異戊醇則賦予蘋果醋辛辣味。
由圖8A可知,國內和國外蘋果醋樣品的分布都較為分散,說明國內外樣品之間的風味差異較大,這些差異也可能是由于不同樣品的發酵方式不同或者原料不同造成的。由圖8B可知,國外濁汁樣品F5、F6和F7分布較為緊密,說明濁汁蘋果醋樣品的揮發性物質組成和含量較相似,而清汁樣品的分布較分散,其揮發性物質組成和含量差異較大,不同樣品的風味較為不同,通過近一步的分析發現,3,5-二甲基苯甲醇、醋酸乙烯酯和異戊酸是形成濁汁和清汁蘋果醋樣品差異的揮發性物質(見圖8C),同時也是形成清汁蘋果醋樣品組內差異的物質。綜上結果可知,蘋果醋的揮發性物質主要檢測到醇類、酯類、酸類、酚類和醛類等物質,所有蘋果醋樣品的揮發性物質總含量基本相似,酸類、酯類和醇類物質占比較高。乙酸、辛酸、異戊酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、琥珀酸二乙酯、苯乙醇和異戊醇是蘋果醋樣品中含量較高的揮發性物質,不同的發酵方式及原料使國內外蘋果醋樣品組間及清汁蘋果醋樣品組內的風味差異較大。
不同來源的蘋果醋理化指標相關性測定結果見圖9。

圖9 不同來源的蘋果醋理化、抗氧化活性和風味特性指標相關性分析結果Fig.9 Correlation analysis results of physicochemical indexes,antioxidant activity and flavor characteristics of apple cider vinegar from different sources
由圖9可知,蘋果醋樣品各理化指標間共有36個相關系數,α=0.05水平上存在顯著相關性的有3個,在α=0.01水平上存在顯著相關性的有5個。還原糖和DPPH自由基清除率(0.54)、多酚(0.77)、氨基酸總含量(0.58)呈極顯著正相關(P<0.01);可溶性固形物和ABTS自由基清除率呈顯著正相關(0.49)(P<0.05);DPPH自由基清除率和總多酚含量呈極顯著正相關(0.86)(P<0.01)、總黃酮含量(0.46)呈顯著正相關,還原力和總黃酮呈極顯著正相關(0.58)(P<0.01),ABTS自由基清除率和總黃酮呈極顯著正相關(0.67)(P<0.01);蘋果醋的總多酚和總黃酮含量會影響蘋果醋的抗氧化性。
本研究通過對比19個不同來源的蘋果醋樣品在有機酸、氨基酸、總酸、揮發性物質、抗氧化性等方面組成差異,基于多重比較和相關性分析對不同來源蘋果醋品質進行評價并篩選特征指標,通過比較得知,不同的蘋果醋樣品在理化、抗氧化活性和風味品質指標上均存在一定的差異。結果顯示,在參試蘋果醋樣品中,國外樣品的總酸含量和DPPH自由基清除率較國內樣品高,還原糖含量和ABTS抗氧化活性較國內樣品低;與國外樣品相比較,國內樣品的氨基酸總含量較高,其中天冬氨酸和丙氨酸是蘋果醋含量較高的氨基酸,蛋氨酸和脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸分別是國內外樣品和清濁汁樣品的差異氨基酸;乙酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸和草酸是國內樣品組內差異有機酸,乙酸和莽草酸是清汁樣品組內差異有機酸;所有樣品的揮發性物質總含量基本相似,酸類、酯類和醇類物質含量較豐富,乙酸、辛酸、異戊酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇和異戊醇等是樣品中含量較高的揮發性物質;相關性結果顯示,蘋果醋中總多酚和總黃酮含量與抗氧化活性呈極顯著正相關(P<0.01)。該研究確定了蘋果醋的主體氨基酸、有機酸以及特征揮發性風味物質,為蘋果醋風味評價及建立部分品質指標提供了理論依據。