抗鐮孢菌根腐類病害復合微生物菌劑培養基及發酵工藝優化

馬佳勇，李雪萍*，李建軍，漆永紅，許世洋

（1.甘肅省農業科學院 植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學 草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020）

復合微生物菌劑是一種具有多種功能的生物活菌制劑，其不僅可以分泌抑菌物質防治植物病害，還可以通過溶磷、固氮、解鉀等特性，提升土壤養分，提高作物產量[1-2]。由于農田環境復雜、氣候多變，單一菌劑的促生功能難以發揮理想效果[3]，而多菌株構建的復合菌劑種類多樣、功能齊全、效果良好[4-5]。耐鹽堿菌劑可以有效調節細胞生理和分子機制，緩解鹽堿對植物的脅迫，改善土壤結構和保水能力，提升土壤有機質，促進植物根系生長[6]。王海霞等[7]研究表明，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）制劑對燕麥炭疽病的田間防治效果高達75.27%，同時促進燕麥株高增加22%，鮮質量增加47%。DENG L等[8]研究表明，采用微生物菌劑和植被聯合改良的手段，可以顯著提高有機質、堿解氮、速效磷及速效鉀含量，促進了紫花苜蓿和黑麥草的生長。因此，耐鹽堿、防病、促生菌劑的開發具有廣泛的應用價值。

微生物菌劑大面積推廣需要具備活性高、儲存久的特點，優化發酵條件及培養基成分可以提高菌劑的生物量和活性，降低生產成本[9-10]。不同環境中分離篩選到的微生物對營養成分及生長條件的要求不同，將菌株混合時難以控制培養條件、碳源、氮源等因素。而正交試驗將多因素多水平的復雜問題簡單化，從而高效篩選出最優條件[11]。李彩聯等[12]通過正交試驗優化得到高產漆酶菌株的發酵條件為5%接種量、15%通氧量、培養溫度30 ℃、培養時間120 h，菌株漆酶活性達9 522 U/g，是優化前的2.06倍。黎燕珊等[13]對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HC-8發酵培養基及發酵條件進行優化，結果表明，在pH 6.0、轉速180 r/min、裝液量20 mL/300 mL的條件下，菌株HC-8對白粉病菌分生孢子萌發的抑制作用顯著提升。CHEN Z M等[14]研究表明，改良培養基成分為16.18 g/L玉米浸膏、17.53 g/L大豆粉、8.14 g/L酵母浸膏時，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）孢子數顯著提升。

我國鹽堿土面積廣泛，土壤鹽堿化問題日益加劇[15]。同時由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）引起的根腐病等土傳病害導致番茄[16]、辣椒[17]、枸杞[18]等經濟作物嚴重減產。因此，本研究針對前期分離、組合、優化的具有耐鹽堿、防病、促生的復合微生物菌劑A8（4%枯草芽孢桿菌F14、6%高地芽孢桿菌MX27、8%高地芽孢桿菌MX38、2%枯草芽孢桿菌MX50、2%解淀粉芽孢桿菌MX66、2%解淀粉芽孢桿菌MX69）為研究對象，采用單因素試驗和正交試驗對復合微生物菌劑培養基成分及發酵工藝進行優化，以復合菌劑生物量、固氮量、解鉀量、溶有機磷量、溶無機磷量和抑菌率為考察指標，采用Topsis綜合評價法確定最佳培養條件，以期為新型復合微生物菌劑的生產實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

復合菌劑A8（4%枯草芽孢桿菌、6%高地芽孢桿菌、8%高地芽孢桿菌、2%枯草芽孢桿菌、2%解淀粉芽孢桿菌、2%解淀粉芽孢桿菌）、腐皮鐮孢菌3-4、尖孢鐮刀菌45-3：本實驗室保藏。供試菌株特性見表1。

表1 供試菌株特性Table 1 Characteristics of the tested strain

表2 種子培養基組分優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for seed medium compositions optimization

表3 發酵培養基組分優化正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation medium compositions optimization

1.1.2 試劑

Ca3（PO4）2、NaCl、KCl和MnSO4·4H2O：上海啟仁化工有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、CaCO3、（NH4）2SO4、MnSO4、KH2PO4和KNO3：浙江聯碩生物科技有限公司；CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaMoO4·2H2O、NaH2PO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·7H2O：武漢卡洛斯科技有限公司；瓊脂、蔗糖、酵母粉、鉀長石、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨：阿勒山生物科技有限公司；生物素、溴百里酚藍、孟加拉紅、可溶性淀粉、硝酸鉀、卵磷脂、鏈霉素和蘋果酸：上海源葉生物科技有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 供試培養基[19]

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15～20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

蒙金娜無機磷培養基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，NaCl 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO40.03 g/L，FeSO40.003 g/L，Ca3（PO4）25 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

蒙金娜有機磷培養基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，KCl 0.3 g/L，NaCl 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）210 g/L，瓊脂粉15～18 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

無氮培養基：蘋果酸5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.02 g/L，NaCl 0.1 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.002 g/L，溴百里酚藍5 mL/L，KOH 4.5 g/L，生物素10 μg/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

鉀長石培養基：葡萄糖10.0 g/L，鉀長石2.5 g/L，Na2HPO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaCO35.0 g/L，CaSO4·7H2O 0.1 g/L，瓊脂20.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

所有培養基均于115 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

5804R型離心機：德國Eppendorf公司；RXZ型智能人工氣候箱、CXZ型智能光照培養箱：寧波江南儀器廠；LabTech型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HZQ-F100型全溫振蕩培養箱：蘇州培英實驗設備有限公司；SpectraMax Plus384 型單功能光吸收酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；Azure C300型化學發光成像系統：美國Azure公司；6400A型火焰光度計：上海精密儀器儀表有限公司；QSY-1型凱氏定氮儀：北京晨曦勇創科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養基成分優化

單因素試驗：將LB培養基中的酵母提取物替換成不同的碳源（0.5%乳糖、0.5%蔗糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%麥芽糖）、將胰蛋白胨替換成不同氮源（1%酵母浸出膏、1%NaNO3、1%（NH4）2SO4、1%NH4Cl）、將NaCl替換成不同無機鹽（1%CaCl2、1%MgSO4、1%MnSO4、1%CuSO4），每個處理3次重復。在優化的發酵條件下培養后，測定復合菌液的OD600nm值、固氮量、解鉀量、溶磷量和抑菌率，測定方法參考許世洋等[20]，進行Topsis綜合分析，根據綜合得分指數（composite score index，CI）確定種子培養基的最佳碳源、氮源和無機鹽。

正交試驗：根據單因素試驗結果，以綜合得分指數（CI）為考察指標，以酵母浸出膏添加量（A）、乳糖添加量（B）和MgSO4添加量（C）為考察因素，進行3因素4水平（L16（43））的正交試驗設計，確定最佳種子培養基組分。

1.3.2 發酵培養基成分優化

單因素試驗：將LB培養基中的酵母提取物替換成不同的碳源（0.5%土豆淀粉、0.5%玉米淀粉、0.5%豆餅粉、0.5%甘露醇）、將胰蛋白胨替換成不同氮源（1%酵母粉、1%玉米漿、1%尿素、1%花生餅粉）、將NaCl替換成不同無機鹽（1%CaCl2、1%MgSO4、1%MnSO4、1%CuSO4），每個處理3次重復。在優化的發酵條件下培養后，計算綜合得分指數（CI），確定發酵培養基最佳碳源、氮源和無機鹽。

正交試驗：根據單因素試驗結果，以綜合得分指數（CI）為考察指標，以玉米漿添加量（A）、豆餅粉添加量（B）和CaCl2添加量（C）為考察因素，進行3因素4水平（L16（43））的正交試驗設計，確定最佳發酵培養基成分。

1.3.3 發酵工藝優化

在pH為7、接種量為1%、轉速160 r/min、溫度30 ℃、發酵時間36 h的基礎上[19-20]，以綜合得分指數（CI）為考察指標，以pH（A）、接種量（B）、轉速（C）、培養溫度（D）和培養時間（E）為考察因素，進行5因素4水平（L16（45））的正交試驗設計，確定最佳發酵工藝，試驗因素與水平見表4。

表4 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.4 分析檢測

菌株生長特性：采用酶標儀測定培養液的OD600nm值[29]；固氮量：采用凱氏定氮法測定[20]；解鉀量：采用火焰光度計法測定[20]；溶磷量：采用鉬銻抗比色法[20]；抑菌率：采用牛津杯法[20]。

1.3.5 數據分析

采用Excel 2016進行原始數據整理，SPSS 24.0進行方差分析，DPS 15.10進行Topsis綜合評價分析。

2 結果與分析

2.1 種子培養基優化

2.1.1 碳源的確定

碳源直接影響菌株生長和代謝產物的積累，是菌株生長所需的主要營養物質[21]。種子培養基碳源對各指標的影響見圖1。由圖1可知，乳糖作為單一碳源時，復合菌系生長濃度、固氮量、溶磷量及抑菌率顯著高于其他處理（P＜0.05）；可溶性淀粉作為單一碳源時，復合菌系解鉀量最高，組間差異顯著（P＜0.05）。由此可見，不同碳源下復合菌系各能力有所差異，究其原因可能與碳源的物理性質及微生物代謝途徑的多樣性有關[22]。通過Topsis綜合分析，乳糖作為單一碳源時，其綜合得分指數（CI）為0.92，綜合能力最強。因此，選用乳糖為種子培養基碳源。

圖1 種子培養基中碳源對各指標的影響Fig.1 Effect of carbon source of seed medium on each indexes

2.1.2 氮源的確定

不同的微生物對氮源的需求不同[23]，種子培養基氮源對各指標的影響見圖2。由圖2可知，以酵母浸出膏作為氮源時，復合菌系固氮量最高，組間差異顯著（P＜0.05）；以NaNO3作為氮源時，復合菌系抑菌率最高；以（NH4）2SO4作為氮源時，復合菌系溶無機磷量最高，但與酵母浸出膏、（NH4）2SO4、NH4Cl組間差異不顯著（P＞0.05）；以NH4Cl作為氮源時，復合菌系OD600nm值、解鉀量及溶有機磷量最高，且顯著高于其余處理（P＜0.05）。通過Topsis綜合分析，酵母浸出膏為氮源時，綜合得分指數（CI）最高，為0.81，其綜合能力最強。由此可見，復合菌系選用有機氮源的效果顯著優于無機氮源[24]，因此，選用酵母浸出膏為種子培養基氮源。

圖2 種子培養基氮源對各指標的影響Fig.2 Effect of nitrogen source of seed medium on each indexes

2.1.3 無機鹽的確定

無機鹽可以影響孢子的形成，間接影響菌劑功能特性[25]，種子培養基氮源對各指標的影響見圖3。由圖3可知，當無機鹽選用MgSO4時，復合菌系OD600nm值、解鉀量、溶有機磷量及溶無機磷量高于其他處理；當無機鹽選用MnSO4時，復合菌系固氮量高于其他處理，組間差異顯著（P＜0.05）；當無機鹽選用CaCl2時，復合菌系抑菌率最高。通過Topsis綜合分析，種子培養基無機鹽為MgSO4時，綜合得分指數（CI）為0.73，其綜合能力最強。因此，選用MgSO4為種子培養基無機鹽。

圖3 種子培養基無機鹽對各指標的影響Fig.3 Effect of inorganic salot of seed medium on each indexes

2.1.4 種子培養基成分優化正交試驗結果

種子培養基各成分含量不同將直接影響發酵液的溶氧量及細胞滲透壓失衡，抑制細胞生長[26-27]。種子培養基成分優化正交試驗結果與分析見表5。由表5可知，B8處理溶有機磷能力最強，溶磷量高達517.30 μg/mL；B12處理溶無機磷能力最佳，溶磷量高達777.63 μg/mL；B15處理固氮能力最好，固氮量高達0.26 g/L，且解鉀能力最強，解鉀量高達122.24 mg/L；B16處理生長濃度最高，OD600nm值達到1.72，且抑菌能力最強，抑菌率高達63.54%。通過Topsis綜合分析，B15處理以0.79的綜合得分指數（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，種子培養基選用2%酵母浸出膏、1%乳糖、1%MgSO4。

表5 種子培養基組分優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for seed medium compositions optimization

2.2 發酵罐培養基優化

2.2.1 碳源優化

發酵培養基中碳源對各指標的影響見圖4。由圖4可知，甘露醇作為單一碳源時，復合菌系生長濃度最好，組間差異顯著（P＜0.05）；豆餅粉作為單一碳源時，發酵復合菌系固氮、解鉀、溶有機磷、溶無機磷能力均優于其他處理，組間差異顯著（P＜0.05）；玉米淀粉作為單一碳源時，發酵復合菌系抑菌特性最優。通過Topsis綜合分析，豆餅粉以0.70的綜合得分指數（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，選用豆餅粉為發酵培養基碳源。

圖4 發酵培養基中碳源對各指標的影響Fig.4 Effect of carbon source of fermentation medium on each indexes

2.2.2 氮源優化

如圖5所示，以玉米漿作為氮源時，發酵復合菌系OD600nm值最高，且溶無機磷能力及抑菌功能最優，組間差異顯著（P＜0.05）；以酵母粉作為氮源時，發酵復合菌系固氮量及解鉀量最高，組間差異顯著（P＜0.05）；以尿素作為氮源時，發酵復合菌系溶有機磷能力最強，組間差異不顯著（P＜0.05）。通過Topsis綜合分析，玉米漿以0.72的綜合得分指數（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，選用玉米漿為發酵培養基氮源。

圖5 發酵培養基中氮源對各指標的影響Fig.5 Effect of nitrogen source of fermentation medium on each indexes

2.2.3 無機鹽篩選

如圖6所示，當無機鹽選用MgSO4時，發酵復合菌系OD600nm值最高，組間差異顯著（P＜0.05）；當無機鹽選用CaCl2時，發酵復合菌系固氮、解鉀、溶磷及抑菌特性均最優，組間差異顯著（P＜0.05）。通過Topsis綜合分析，CaCl2以0.95的綜合得分指數（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，選用CaCl2為發酵培養基無機鹽。

圖6 發酵培養基中無機鹽對各指標的影響Fig.6 Effect of inorganic salt of fermentation medium on each indexes

2.2.4 發酵培養基優化正交試驗

如表6所示，不同含量的玉米漿、豆餅粉、CaCl2對發酵復合菌系的特性均有影響，各處理之間差異顯著（P＜0.05）。C9處理固氮能力、溶有機磷、抑菌能力均最好，其固氮量為0.23 g/L，溶磷量為504.54 μg/mL，抑菌率達60.97%；C11處理解鉀能力最好，解鉀量達105.72 mg/L；C13處理溶無機磷能力最好，溶磷量達728.64 μg/mL；C16處理生長濃度最高，OD600nm值達到1.77。由此可見，不同含量的玉米漿、豆餅粉、CaCl2對復合菌系特性均有影響，通過Topsis綜合分析，C9處理以0.84的綜合得分指數（CI）排名第一，其綜合能力最強。因此，發酵培養基選用0.1%豆餅粉、1.5%玉米漿、1.5%CaCl2。

表6 發酵培養基組分優化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation medium compositions optimization

2.3 發酵條件優化正交試驗

微生物發酵過程較為復雜，次級代謝物質的合成容易受溫度、pH、轉速、接菌量等因素的影響[28]。如表7所示，其中，D1處理溶有機磷能力最強，其溶磷量為553.74 μg/mL；D2處理生長濃度最高，其OD600nm值為1.06，且溶無機磷能力最強，其溶磷量為822.67 μg/mL；D3處理固氮能力最強，其固氮量為0.24 g/L；D8處理抑菌能力最強，其抑菌率為58.44%；D12處理解鉀能力最強，其解鉀量為121.45 mg/L。由此可見，復合菌系功能特性在不同的發酵條件下各不相同，究其原因可能與菌劑中各菌株的種屬及生存環境有關[29]。通過Topsis綜合分析，D3處理的綜合得分指數（CI）為0.89，綜合能力最強。因此，確定復合菌系的最佳發酵條件為pH 6、接種量9%、轉速180 r/min、溫度35 ℃、發酵時間35 h。

表7 發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

3 結論

本研究以具有耐鹽堿、防病、促生的復合微生物菌劑為研究對象，通過單因素試驗和正交試驗對復合微生物菌劑發酵條件、培養基成分及含量進行優化。結果表明，復合微生物菌劑最適種子培養基為2%酵母浸出膏、1%乳糖、1%MgSO4；最適發酵培養基為0.1%豆餅粉、1.5%玉米漿、1.5%CaCl2；最佳發酵條件為pH 6、接種量9%、轉速180 r/min、發酵溫度35 ℃、發酵時間35 h。此優化培養條件下，復合菌系的OD600nm值為1.38、固氮量為0.23 g/L、解鉀量為101.00 mg/L、溶有機磷量為504.54 μg/mL、溶無機磷量為658.82 μg/mL、抑菌率為60.97%。本研究為復合菌系工業化生產及推廣提供理論和技術支撐。