中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦的安全性評價

張銘林，歐夢馨，謝映紅，肖 琦，周琳玉，謝小東，胡庭俊

（ 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 53005 ）

南美白對蝦是世界上體型最大、產量最高的對蝦之一，具有肉質鮮美、生長迅速、營養豐富等特點，其產量占全球對蝦產量的80%以上[1]。近年來，南美白對蝦的養殖規模和密度不斷增大，養殖池中大量的飼料、對蝦排泄物、殘留飼料等可導致養殖水體惡化，威脅對蝦健康[2]。采用傳統的抗生素防治疾病，使病原菌對抗生素產生抗藥性[3]。因此，人們更加關注替代抗生素的疾病防治方法。其中草藥微生態制劑結合了中草藥和益生菌的雙重優勢，不僅具備提高動物生長性能、免疫功能、抗氧化和抗炎能力[4]，還能夠通過抑制病原菌、增強免疫反應提高機體的抗病力[5]，因而受到廣泛關注。本實驗室通過將山藥、馬齒莧等中草藥和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等益生菌配制而成一劑中草藥微生態復方制劑，并在前期研究中發現該制劑能夠有效增強南美白對蝦的生長性能和免疫功能水平[6]。為進一步探究中草藥微生態復方制劑作用于南美白對蝦的安全劑量范圍，證明中草藥微生態復方制劑對于南美白對蝦的安全性，本試驗通過觀察對蝦在超過推薦劑量下的生長性能、臨床表現、血液生化指標和病理組織學分析，對該制劑的安全性進行評價，為后續的臨床應用開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物

中草藥微生態復方制劑含有山藥、馬齒莧、黃精等中藥和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等益生菌菌粉，由廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室配制。

1.1.2 試驗動物

試驗用南美白對蝦750 尾，體重（2.0±0.3） g，體長（5.0±1.0） cm，來自廣西東興南美白對蝦養殖基地。對蝦臨床表現健康，采食正常，蝦線正常。

1.1.3 試劑與儀器

總蛋白定量（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；飼料專用黏合劑購自北京鑫洋水產高新技術有限公司；檸檬酸三鈉（分析純）購自北京索萊寶科技有限公司；Bouin's固定液購自北京索萊寶科技有限公司。

UV-1750 型紫外可見光分光光度計（島津公司）、Multimode Plate Reader 酶標儀（PerkinElmer）、Direct-Q 5UV 純水系統（Merck Millipore）、AB104-L 電子分析天平（梅特勒-托利多）、3K-15 臺式高速冷凍離心機（Sigma）、HH-S2 數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療器械廠）、ZT-12M2自動生物組織病理脫水機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司）、YB-6LF 生物組織包埋機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司）、LEICA RM2245半自動輪轉式切片機（徠卡公司）、YT 型生物組織攤烤片機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司）、YR-21 生物組織切片染色機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司）、光學顯微鏡（Nikon eclipse 80i）。

1.2 試驗飼料制備

根據實驗室前期研究，中草藥微生態復方制劑的臨床推薦劑量為每1 kg 飼料中添加10 g。飼料制備時按照比例準確稱取中草藥微生態復方制劑和南美白對蝦商品料后，再按照飼料專用黏合劑說明書用量稱取適量黏合劑加入復方制劑中，隨后添加適量純水迅速攪拌均勻呈稀糊狀，最后混合入稱取的南美白對蝦商品料中，充分翻拌混勻，使復方制劑包裹在蝦飼料上，在通風處晾干。

1.3 試驗設計與飼養管理

750 尾南美白對蝦隨機分為5 組，每組3 個重復，每個重復150尾蝦。設置1個空白對照組和4個試驗劑量組，各試驗組添加中草藥微生態復方制劑劑量分別為推薦劑量的1、3、5、10倍劑量。試驗分組及處理見表1。

表1 試驗分組及處理Tab.1 Grouping and treatment of experimental animals

養殖試驗在廣西東興市鴻生實業有限公司的室內專業養殖車間進行，試驗蝦養殖于2 m×2 m專業養殖池內，水深0.8 m左右。將750尾試驗蝦隨機分到15個小養殖池內，每個小養殖池50尾，試驗開始前正常養殖7 d以適應環境。養殖用水為過濾海水，水溫（28±2） ℃，pH值8.0～8.4，24 h充氧，鹽度為23.0‰，每天清污一次，每兩天換水一次，每次換水量1/4。各組投喂相應的試驗飼料，每天投喂4次（時間分別為8:00、12:00、17:00、22:00），每天投喂量為蝦體重的1%～3%，投喂1 h后清除剩余飼料。試驗期30 d。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 臨床體征觀察

從給藥開始連續觀察30 d，每日觀察受試蝦的臨床表現、采食與排便的情況并記錄。

1.4.2 體重與體長

用藥后第15 和第30 d 時，每組隨機撈取30 尾受試蝦測定體重和體長，并計算30 d 的平均增重率和平均增長率。同時完整剖取出受試蝦的肝胰腺，稱量后用Bouin's固定液固定，計算肝胰腺的臟器指數。

1.4.3 血液生化指標

用藥后第15和第30 d時，每組隨機撈取30尾蝦抽血。用75%酒精將南美白對蝦的腹血竇部位消毒，先抽取適量預冷的抗凝劑（5%檸檬酸三鈉），在與蝦體成45°左右的方向進針抽取受試蝦血液，將血液轉移至1.5 mL 滅菌EP 管中混勻，抗凝劑補足體積至與血液體積比為1∶1，-40 ℃保存。測定TP、ALB、CREA、ALT、AST 和TG 等指標，測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作，注意先進行預試驗確認測試濃度，若需要稀釋可用生理鹽水。

1.4.4 組織病理學檢查

取固定好的肝胰腺，通過酒精逐級脫水、石蠟切片、蘇木素伊紅（HE）染色、脫水封片等步驟進行病理組織切片制作，觀察肝胰腺組織形態是否發生變化,并采集圖像。

1.5 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析，Duncan's 法進行多重比較。結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著 。

2 結果與分析

2.1 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦臨床表現的影響

試驗期內，各池中南美白對蝦攝食情況良好，運動活躍，蝦線呈正常的棕黑色，流暢無斷節，糞便粗細均勻，顏色正常，長度1～2 cm，無異常氣味，未出現中毒表現。

2.2 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦體指數的影響（見表2、表3）

表2 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦體重及肝胰腺指數的影響Tab.2 Effects of Chinese herbal microecological compound preparation on body weight and hepatopancreas index of Penaeus vannamei

表3 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦體長的影響Tab.3 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on body length of Penaeus vannamei

由表2可知，用藥后第15 d時，Ⅱ組、Ⅲ組對蝦的體重顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅳ組對蝦的體重極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01）；用藥后第30 d時，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組的體重極顯著大于Ⅰ組（P＜0.01）。用藥后第30 d時，Ⅱ組平均增重率最大（199.06%），Ⅰ組最小，僅有115.09%。

由表3可知，用藥后第15 d時，Ⅱ組、Ⅲ組對蝦的體長顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅳ組的體長極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01）；用藥后第30 d時，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組的體長極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01）。用藥后第30 d，Ⅲ組的平均增長率最大，為49.61%；Ⅰ組的平均增長率最小，為37.07%。

2.3 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦血液生化指標的影響（見表4～表6）

表4 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦血液TP和ALB含量的影響Tab.4 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on blood TP and ALB content of Penaeus vannamei

由表4 可知，用藥后第15 d 時，Ⅴ組對蝦血液TP 和ALB 含量均顯著低于Ⅰ組（P＜0.05）。用藥后第30 d 時，Ⅳ組和Ⅴ組對蝦血液TP含量極顯著性高于Ⅰ組（P＜0.01），Ⅳ組的ALB 含量極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01），Ⅴ組的ALB含量顯著高于Ⅰ組（P＜0.05）。

由表5可知，用藥后第15 d，Ⅱ組對蝦血液ALT活性、Ⅳ組對蝦血液AST 活性極顯著低于Ⅰ組（P＜0.01），Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組對蝦血液ALT 活性及Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅴ組對蝦AST活性均顯著低于Ⅰ組（P＜0.05）。

表5 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦血液ALT和AST活性的影響Tab.5 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on the activity of ALT and AST in blood of Penaeus vannamei

由表6 可知，用藥第15 d，與Ⅰ組相比，Ⅲ組和Ⅴ組對蝦血液CREA 含量顯著降低（P＜0.05）；Ⅱ組TG 含量顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組極顯著降低（P＜0.01）。

表6 中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦血液CREA和TG含量的影響Tab.6 Effects of Chinese herbal microecological compound preparation on blood CREA and TG content of Penaeus vannamei

2.4 組織病理學檢查（見圖1、圖2）

圖1 給藥15 d后南美白對蝦肝胰腺組織切片（HE 400×）Fig.1 Hepatopancreas tissue section of Penaeus vannamei 15 d after administration（ HE 400×）

解剖可見各組對蝦肝胰腺均未見明顯病變，外層白色薄膜包裹內層組織，外觀正常。

由圖1、圖2可知，各劑量組與空白對照組對蝦肝胰腺細胞核、質清晰，組織飽滿，管腔呈星形，小葉腔空隙正常，空泡數量無異常增多，肝胰腺小管未出現萎縮，未見異常病理變化。

3 討論

本研究采用中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦連續拌料飼喂30 d，評估其在臨床應用中的安全性。結果表明，試驗期內，受試蝦的攝食行為、運動行為正常，糞便的顏色、質地、氣味也無異常，無中毒和死亡現象，表明中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦的臨床體征無不良影響。試驗期間，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組對蝦體重和體長與Ⅰ組相比明顯增加，說明以1、3 和5 倍劑量的中草藥微生態復方制劑拌料飼喂南美白對蝦能夠提高其生長性能，這與中草藥微生態復方制劑中含有豐富的氨基酸、維生素與微量元素等有關。同時益生菌能夠調節腸道微生態平衡，促進消化與吸收，使機體生長性能得到有效提升[7]，這種提升效果在仔豬[8]、產蛋雞[9]、鯉魚[10]等動物中均有報道。

試驗期間，Ⅴ組對蝦血液TP 和ALB 含量呈先下降后升高的趨勢，而Ⅳ組對蝦血液TP 和ALB 含量在用藥30 d時顯著高于Ⅰ組。由于血液TP由肝臟合成，且TP中包含ALB，因此TP 和ALB 的檢測結果能夠反映肝臟合成功能[11]。齊飛等[12]在飼料中添加1%復合芽孢桿菌制劑飼喂凡納濱對蝦，發現血液TP 和ALB 含量顯著上升。陳家祥等[13]研究發現，飼料中添加地衣芽孢桿菌會提高肉雞血清ALB含量。上述研究結果均表明，中草藥微生態復方制劑拌料飼喂對南美白對蝦血液TP和ALB含量無負面影響。

在甲殼動物中，機體肝臟組織受損時會影響肝臟內氨基酸的代謝水平，同時大量的ALT 和AST 被釋放到血淋巴中[14]，導致血液AST 和ALT 活性顯著升高。本研究中，各劑量組對蝦血液AST 和ALT 活性均未明顯升高，肝胰腺指數也無明顯變化，肝胰腺組織顯微結構與正常肝胰腺組織結構相似，這些結果均證明中草藥微生態復方制劑不會對南美白對蝦的肝胰腺組織造成損害。TG是南美白對蝦血脂的主要成分之一，主要由肝臟合成代謝，其數值變化能夠反映對蝦體內脂代謝水平[15]。試驗期間，各劑量組對蝦血液TG 含量呈先下降后上升的趨勢，推測是由于中藥中的植物蛋白源導致機體TG含量短時間內出現小范圍下降所致[16]。血液CREA 含量上升常提示機體存在潛在的腎功能代謝障礙[17]，而下降一般認為無實際臨床意義。本研究中，各劑量組對蝦血液CREA 含量均低于Ⅰ組，與謝小東等[18]結果一致，說明中草藥微生態復方制劑對南美白對蝦肝臟脂質合成與代謝功能無明顯破壞作用。

4 結論

本研究結果表明，飼料中添加1倍、3倍、5倍和10倍推薦劑量的中草藥微生態復方制劑飼喂南美白對蝦30 d，不會對南美白對蝦的血液生化指標造成不良影響，不會損害肝胰腺功能與組織結構，且對南美白對蝦無毒副作用，使用安全，且對南美白對蝦的生長性能具有促進作用。