胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ蛋白重組腺病毒載體構建及免疫原性研究

顏運秋，黎滿香，趙梟健，龍 娉

（ 湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128 ）

豬傳染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種豬呼吸系統的接觸性傳染病，急性型會導致豬突然死亡[1]，是豬場重點防控的疾病之一[2-4]。目前，疫苗防控是預防PCP 的主要途徑，國內市場上針對PCP的疫苗主要為滅活疫苗，但因交叉保護力不夠等原因導致滅活疫苗使用并不普遍。此外，口服疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等可能具有顯著的防控效果，有望解決傳統疫苗存在的非特異性反應強、免疫效果不確實、保護期短等問題而受到廣泛關注[5]。因此，研發有效的新型APP疫苗非常迫切。

APP 的侵襲力和持久性與眾多毒力因子相關，Apx 毒素是其主要的毒力因子之一[6]。Apx毒素包括ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，其中各型APP的ApxⅡ基因序列幾乎完全一致，可作為疫苗的候選基因。重組五型腺病毒載體在新冠肺炎疫苗研究和臨床應用中顯示出很高的安全性和良好的免疫原性[7-8]，在獸醫中的研究也較多。肖莉等[9]構建了輪狀病毒（PoRV）VP4 基因的重組腺病毒rAd-VP4，免疫豬后分別在第42和28 d產生較高的免疫球蛋白G（IgG）抗體水平，表明rAd-VP4可開發成PoRV的候選疫苗。王燦燦等[10]研究表明，口蹄疫病毒衣殼蛋白的重組腺病毒免疫小鼠后可誘導機體產生高水平的特異性抗體以及干擾素-γ（γ-IFN）和白細胞介素-10（IL-10）應答反應，表明該重組腺病毒具有良好的免疫原性。本研究將APP的ApxⅡ基因克隆到pDC316 穿梭載體，與腺病毒骨架載體pBHGlox(delta)E13Cre 共轉染HEK293 細胞，獲得攜帶放線桿菌APXⅡ基因的重組腺病毒載體疫苗rAd-APXⅡ，免疫小鼠后通過檢測血清中ApxⅡ特異性抗體水平以及IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平判斷疫苗的免疫效果，以期為新型APP疫苗的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、質粒及細胞株

大腸桿菌DH5α、腺病毒穿梭載體pDC316 和腺病毒骨架載體pBHGlox(delta)E13Cre由湖南農業大學預防獸醫學實驗室保存。HEK293腺病毒包裝細胞購自ATCC。

1.1.2 試劑、試劑盒和引物

EcoRI、XhoI、T4 DNA 連接酶及Taq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）；轉染試劑Lipo2000（Invitrogen 公司）。DMEM高糖細胞培養基、胰酶溶液（Hyclone公司）；胎牛血清FBS 和雙抗（青霉素/鏈霉素）溶液（Gibco 公司）；小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 ELISA 檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。其余試劑均為分析純。

引物為F：GTTCTCGAGACCATGGTAATGTCAAAA ATCACTTTGTC；R：GGGGAATTCTCAGTAGATGCGATTAATGCAGCGA，由通用生物（安徽）有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 pDC316-APXⅡ載體構建和鑒定

用引物F/R 擴增APP 基因組DNA 中的APXⅡ基因，將其亞克隆到pDC316 載體中的EcoRI 和XhoI 酶切位點中，轉化到大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，提取陽性克隆pDC316-APXⅡ的質粒，進行雙酶切鑒定。

反應體系（20 μL）：pDC316-APXⅡ 6 μL、EcoRI 1 μL、Xho I 1 μL、10×Buffer 2 μL、H2O 10 μL。上述酶切體系37 ℃水浴反應30 min 后，進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性克隆命名為pDC316-APXⅡ。

1.2.2 rAd-APXⅡ重組病毒包裝、純化和病毒滴度測定

采用中提試劑盒提取pDC316-APXⅡ和pBHGlox(delta)E13Cre 的質粒。在10 cm 培養皿里種1×106個HEK293 細胞，培養到細胞鋪滿皿底約80%～90%。使用Lipo2000脂質體進行轉染，取1 μg pDC316-APXⅡ質粒和3 μg pBHGlox(delta)E13Cre 的質粒加入0.5 mL 無血清的DMEM培養基，同時取10 μL Lipo2000加入0.5 mL無血清的DMEM 培養基中室溫靜置10 min。將質粒溶液逐滴加入含Lipo2000的溶液中，混勻，室溫靜置15 min；之后溶液加入HEK293 細胞中，6 h 換含10%FBS 的DMEM 完全培養基繼續培養。

細胞長滿后按1∶3 進行傳代，培養基為10%FBS 的完全培養基；傳代3 d 后，每天觀察細胞病態反應（CPE）；當細胞有明顯的CPE現象，且50%以上脫壁時即收細胞進行裂解收集病毒。再次放大培養，接種病毒，收集細胞沉淀，用PBS洗3遍，按照細胞培養上清的1/10體積加入PBS進行細胞重懸，-80、37 ℃反復凍融3次，離心，收集上清。

采用定量PCR 方法測定病毒滴度。引物序列如下：APX Ⅱ -120F：5'-AGAAAGCTGCCGCAGGTGTA-3'，APXⅡ-120R：5'-CGACAGGACCAGTTGAAGACAA-3'，APX Ⅱ-120PROBE：5'-FAM-ATAGGTAATGTAACAAAAGCGGT-BHQ1-3'。反應體系：2×PCR mix 10 μL、APXⅡ-120F 1 μL、DNA 2 μL、H2O 5 μL、APXⅡ-120R 1 μL、APXⅡ-120PROBE 1 μL。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，40個循環；60 ℃ 30 s。

1.2.3 rAd-APXⅡ免疫小鼠和血清收集

在小鼠模型上研究重組rAd-APXⅡ疫苗的免疫劑量。選擇SPF級別的昆明小鼠（4～6周齡，購自湖南景達實驗動物有限公司）20 只，隨機分成4 組，每組5 只小鼠。將重組腺病毒載體+生理鹽水制成疫苗，注射體積為50 μL。rAd5-Null 組注射未插入基因的空載體包裝的重組病毒，rAd-APXⅡ-低組、rAd-APXⅡ-高組注射的是重組腺病毒載體疫苗，并設置疫苗對照組（注射放線桿菌滅活疫苗）。免疫前24 h和疫苗免疫組第二次免疫后第2周采血一次，制備血清凍存于-70 ℃冰箱。試驗設計見表1。

表1 試驗設計Tab.1 Immune grouping and situation

1.2.4 小鼠血清中APXⅡ抗體的ELISA檢測

包被上步制備的APXⅡ蛋白抗原（實驗室原核制備和保存），以1 mg/L 濃度，每孔100 μL 包被96 孔酶標板，37 ℃ 2 h，用PBST（PBS+吐溫）洗滌。每孔加100 μL 5%脫脂乳的PBST封閉液，37 ℃封閉1 h，洗滌；每孔加入PBS稀釋（1∶100）的待檢免疫血清，37 ℃孵育1 h，洗滌；每孔加入PBS稀釋（1∶2 000）的HRP（辣根過氧化物酶）標記的羊抗小鼠IgG 作為二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌；每孔加入100 μL TMB顯色液（3, 3', 5, 5'-四甲基聯苯胺），室溫顯色10 min后每孔加入50 μL 2 mol/L的硫酸終止反應，酶標儀測OD450nm值。

1.2.5 小鼠血清中的IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體的ELISA檢測

嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作檢測血清中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 16.0 軟件進行統計，方差齊時采用LSD 法進行組間兩兩對比，方差不齊時采用Dunnett 法進行方差分析；兩變量間關系采用直線相關分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 pDC316-APXⅡ雙酶切鑒定結果（見圖1）

圖1 pDC316-APXⅡ雙酶切結果Fig.1 Results of pDC316-APXⅡ double enzyme digestion

由圖1可知，試驗獲得了預期大小的目的片段，說明成功構建了pDC316-APXⅡ載體。

2.2 病毒包裝和滴度測定結果

正常、收毒前的Hek293細胞見圖2、圖3。

圖2 正常的Hek293細胞Fig.2 Normal Hek293 cells

圖3 收毒前的Hek293細胞Fig.3 Hek293 cells before exposure

由圖2、圖3 可知，收毒前的Hek293 細胞變圓脫落，符合腺病毒出毒時的形態。

采用熒光定量PCR檢測病毒滴度，根據標準品擴增曲線（見圖4）的CT 值和對應濃度計算得到標準曲線方程。病毒樣本稀釋100倍后，檢測的CT值為14.20（見圖5），根據標準曲線計算得到病毒滴度為1.20×1010個/mL。

圖4 標準品標準曲線Fig.4 Amplification curves of standards

圖5 病毒樣本滴度Fig.5 Virus sample titer

2.3 免疫后的血清APXⅡ IgG抗體水平（見表2）

由表2可知，rAd5-Null組沒有產生特異的APXⅡ IgG抗體；低、高濃度rAd-APXⅡ組均可產生較高的APXⅡIgG 抗體，其中高濃度組產生的抗體水平顯著高于低濃度組（P＜0.05）；疫苗對照組產生的APXⅡ IgG 抗體水平高于rAd-APXⅡ低濃度組（P＜0.05），但低于rAd-APXⅡ高濃度組（P＜0.05）。

2.4 免疫后的血清IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體水平（見表3）

表3 免疫后小鼠血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平Tab.3 Serum IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 antibody levels in immunized mice

由表3 可知，低、高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗對照組的IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體顯著高于rAd-Null 組（P＜0.05）；高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗對照組抗體顯著高于低濃度rAd-APXⅡ組（P＜0.05）；高濃度rAd-APXⅡ組抗體水平略高于疫苗對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，rAd-APXⅡ組的細胞免疫應答和體液免疫應答水平均得到了顯著提高。

3 討論

本研究中，雙酶切鑒定結果顯示獲得了3 700 bp 的載體片段和925 bp 的目的基因片段，表明試驗成功構建了pDC316-APXⅡ載體，為下一步重組腺病毒的包裝做好了準備。根據轉染前后Hek293 細胞的形態變化，可知轉染質粒在細胞內轉錄和翻譯后，組裝成的重組病毒量引起細胞變圓和脫落，定量PCR 檢測結果表明成功包裝了病毒。研究表明，APxⅡ是一種有活性的抗原。楊術杰等[11]在谷氨酸棒桿菌中表達截短的ApxⅡ蛋白可與豬抗ApxⅡ陽性血清進行特異性免疫，研究結果為獸用疫苗產業提供了質量可靠、低成本表達體系。萬玉萌等[12]將含APXⅡ的重組質粒轉化Rosetta 感受態細胞，通過IPTG 誘導表達，應用His單克隆抗體和臨床陽性豬血清對表達的重組蛋白上清進行Western blot 分析。結果表明，APXⅡ重組蛋白可以穩定表達可溶性蛋白，可溶性蛋白能與His 單克隆抗體和臨床陽性豬血清發生特異性反應，證明APXⅡ重組蛋白具有良好的免疫反應性。

本研究結果表明，rAd5-Null 組沒有產生特異的APXⅡ IgG抗體；低和高濃度rAd-APXⅡ組均可產生較高水平的APXⅡ IgG抗體，且高濃度組產生的抗體顯著高于低濃度組；疫苗對照組產生的APXⅡ IgG 抗體水平高于rAd-APXⅡ低濃度組，低于rAd-APXⅡ高濃度組。結果表明，rAd-APXⅡ注射小鼠后能夠表達APXⅡ蛋白，同時刺激機體產生特異性的抗體。IgG1水平升高，表明保護性免疫中免疫應答向Th2（體液免疫應答）方向發展；IgG2a 水平升高，提示保護性免疫中免疫應答向Th1（細胞免疫應答）方向發展[13-15]。本研究結果表明，低、高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗對照組的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平顯著高于rAd-Null 組；高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗組抗體水平顯著高于低濃度rAd-APXⅡ組；高濃度rAd-APXⅡ組抗體水平略高于疫苗對照組，但差異均不顯著。上述結果表明，rAd-APXⅡ組小鼠的細胞免疫應答和體液免疫應答水平均得到顯著提高。

綜上所述，包含APXⅡ基因的重組腺病毒載體rAd-APXⅡ，僅需一次注射即可刺激機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。與滅活苗相比，本研究的重組腺病毒載體rAd-APXⅡ生產成本低，應激小，可作為預防和治療放線桿菌的疫苗。

4 結論

本研究構建的APP APXⅡ基因的重組五型腺病毒載體rAd-APXⅡ能夠產生很好的細胞免疫應答和體液免疫應答水平，為進一步的疫苗研究奠定了基礎。