基于F 基因的鴿新城疫病毒分子特征分析

汪 萍，苗書魁，魏玉榮，夏 俊

（ 新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆 烏魯木齊 830011 ）

新城疫是由副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬禽副黏病毒Ⅰ型（APMV-1，也稱新城疫病毒）引起的病毒病，在我國被列為二類動物疫病[1]。新城疫病毒（NDV）不斷進化共產生21 種基因型，可感染240 多種鳥類，在遺傳、毒力、抗原性和寄主范圍等方面具有高度多樣性[2]。1975年，新城疫第三次大流行從鴿子開始，傳播到世界各地[3-4]。鴿新城疫于20 世紀80 年代傳入我國，APMV-1 基因型Ⅵ是造成這一流行病的主要原因，也稱鴿副黏病毒-1（PPMV-1）[5]。NDV 是一種負鏈RNA 病毒，NDV 基因組可編碼6 種結構蛋白：核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經氨酸酶（HN）和大蛋白（L）以及兩種非結構蛋白V和W，其中定位于病毒囊膜的F蛋白通常被認為是NDV毒力的分子標記[6]。隨著新疆畜牧產業結構調整，養鴿業已成為和田地區的主導產業之一，除了采取對規模化養殖場鴿子進行疫苗免疫的預防措施外，還需了解鴿新城疫流行現狀及病毒的分子特征。本試驗以新疆和田地區規模化養鴿場流行病學調查陽性樣品為研究對象，進行基于F基因的鴿新城疫病毒分子特征分析，為制定系統、有效的鴿新城疫防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020—2022年，本實驗室分別從新疆和田地區6個縣市的規模化肉鴿養殖場采集81份臨床癥狀疑似感染NDV的鴿子肺和脾臟組織，冷鏈運輸至實驗室-20 ℃保存。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒購自QIAGEN 公司；One step RTPCR kit 購自Takara 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自AXYGEN 公司。F基因特異性引物序列為5'-AGGCACCCAACGTGCTGTCG-3'；5'-ACGGAGACTCAAGGGCCACC-3'[2]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 RNA提取及RT-PCR擴增

組織樣品用無菌剪刀剪碎，于組織勻漿器中充分研磨后置于含抗生素的PBS（0.01 mol/L、pH 值7.0～7.4）中，制成濃度為10%的混懸液，凍融3 次，8 000 r/min 離心10 min，取上清提取病毒RNA。按QIAGEN RNeasy MINI Kit 說明書提取病毒RNA，利用One step RT-PCR kit 進行RT-PCR，取2 μL提取的RNA進行RT-PCR。

反應體系：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL、上下游引物各0.5 μL（20 μmol/L）、2×1 Step Buffer 12.5 μL、Template RNA 1 μL、RNase Free dH2O 9.5 μL。

反應條件：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃ Taq 酶激活2 min；94 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。RT-PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，樣品出現約535 bp目的片段判為NDV核酸陽性。統計陽性結果，計算各地區陽性率。

1.4 F基因擴增與序列分析

將RT-PCR 鑒定陽性樣本，取5 μL 提取的RNA 于50 μL反應體系進行RT-PCR擴增。

反應體系：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、上下游引物各1 μL（20 μmol/L）、2×1 Step Buffer 25 μL、Template RNA 3 μL、RNase Free dH2O 18 μL。

反應條件：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 次循環；72 ℃延伸7 min。RT-PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，出現約1 600 bp目的片段判為F基因擴增陽性。凝膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

使用Lasergene7.0 軟件中Clustal W 和MegAlign 功能進行同源性分析，MEGA5.0軟件進行遺傳進化分析，NCBI在線工具MSA Viewer比較不同F基因的分子特征。

2 結果與分析

2.1 規模化養鴿場鴿新城疫流行病學調查結果

和田地區6 個規模化養鴿場中選擇出現糞便稀薄，呈黃綠色或黃白色，扭頸、癱瘓等神經癥狀的病鴿，采集病料進行鴿新城疫病毒檢測。

RT-PCR結果顯示，81份樣品中有12份樣品擴增到目的片段，和田地區鴿新城疫陽性率14.81%（12/81），其中縣市1 陽性率11.77%（2/17），縣市2 陽性率11.11%（1/9），縣市3陽性率18.75%（3/16），縣市4陽性率15.79%（3/19），縣市5陽性率11.11%（1/9），縣市6陽性率18.18%（2/11）。部分樣品RT-PCR產物電泳結果見圖1。

圖1 部分樣品RT-PCR產物電泳結果Fig.1 Electrophoretic results of RT-PCR products of some samples

2.2 基于F基因的核苷酸同源性分析（見圖2、圖3）

圖2 F基因RT-PCR擴增結果Fig.2 RT-PCR amplification results of F gene

圖3 不同毒株F基因核苷酸同源性分析Fig.3 Nucleotide homology analysis of F gene in different strains

從流行病學調查陽性樣品中選擇分別代表不同縣市和養鴿場的6株F基因擴增產物進行純化后測序，見圖2。

由圖2可知，所測6株序列與GenBank中PPMV-1的F基因序列一致，分別命名為:NDV/PIGEON/XJHT/446/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/467/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/491/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/472/2021/F、NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 以及NDV/PIGEON/XJHT/812/2022/F。上述6株分離毒株與國內外11株F基因核苷酸序列進行同源性分析，結果見圖3。

由圖3 可知，6 株F基因之間核苷酸同源性為97.7%～99.9%，與甘肅、寧夏來源的分離株核苷酸同源性為97.3%～99.5%，與國內其他省份來源的分離株核苷酸同源性為97.2%～98.6%。6 株分離株F基因與基因Ⅱ型疫苗株LaSota 株、HB1 株、VG/GA 株、Clone30 株核苷酸同源性為83.5%～84.7%，與基因Ⅲ型Mukteswarz 株核苷酸同源性為84.9%～85.7%。

2.3 基于F基因的遺傳進化分析

分別與GenBank 中43 株代表不同基因型PPMV-1 的F基因進行核苷酸序列比對，并構建進化樹，結果見圖4。

由圖4 可知，所測6 株F基因序列均屬Ⅵ.2.1.1.2.2，其中NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 與分離自寧夏的MG840654.1 親緣關系最近，同在一個小分支內；而其他5 株F基因（NDV/PIGEON/XJHT/446/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/467/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/491/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/472/2021/F、NDV/PIGEON/XJHT/812/2022/F）均在同在一個小分支內；6 株F基因序列均與甘肅的OM640464.1 親緣關系較近，與基因Ⅱ型疫苗株親緣關系最遠。

2.4 F蛋白主要功能區的分子特征分析（見表1）

表1 6株F蛋白功能域中氨基酸突變Tab.1 Amino acid mutation in functional domain of six F protein

由表1 可知，對比6 株F 蛋白和10 株國內流行株主要功能區域的分子特征，結果顯示，F 蛋白裂解位點序列均為112R-R-Q-K-R-F117，6株分離株F蛋白N端信號肽區的第4、5位點有苯丙氨酸、蘇氨酸的插入，第6位點絲氨酸突變為酪氨酸。6株分離株F蛋白融合肽區均有兩處氨基酸突變（V121I、A132S），HRa 區均有1 處氨基酸突變（V179I），其中NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 在HRb、HRc 有一個氨基酸突變（L298F 和K483R），在跨膜區有2個氨基酸突變（V509I、V512I）。

3 討論

除APMV-1基因型Ⅵ外，APMV-1基因型ⅩⅪ也會引起鴿新城疫暴發。2017 年，巴基斯坦鑒定出APMV-1 基因型ⅩⅪ.1.1 和ⅩⅪ.1.2[7]。2011—2015 年，趙振振[8]從我國部分地區分離到基因Ⅵb 亞型鴿新城疫病毒11 株。2021—2022 年，彭真奇等[9]從不同地區鴿群中分離到8 株NDV 代表株，均屬于基因Ⅵ型；Zhan 等[10]通過對186 株中國PPMV-1分析證實目前中國亞基因型Ⅵ.2.1.1.2.2最多，其次是亞基因型Ⅵ.2.1.1.2.1、Ⅵ.2.2.2和Ⅵ.1。本試驗中的6 株鴿新城疫流行株鑒定為亞基因型Ⅵ.2.1.1.2.2，與目前APMV-1 基因Ⅵ亞型在我國鴿群中流行的特征相符。綜上，Ⅵ.2.1.1.2.2目前是我國鴿新城疫主要流行基因型。

據報道，融合肽和HR區的氨基酸替代或NDV跨膜結構域的替換可能會影響F蛋白的融合活性，進而影響病毒的致病性[11]。本試驗中6株F蛋白的主要功能區域均發生了點突變，其中NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 在HRb、HRc和跨膜區出現1～2個氨基酸突變。

在不斷開發新城疫疫苗的背景下，鴿NDV 的進化選擇壓力增加。有研究報道，NDV的所有編碼基因和一些非編碼區中均發現了來自疫苗譜系和循環病毒譜系的自然同源重組，活疫苗株可能通過與循環病毒的同源重組在NDV 進化中發揮作用[12-13]。有研究發現，F 蛋白裂解位點序列112R-R-Q-K-R-F117雖然具有強毒株的特征，但NDV的毒力指標如雞腦內接種致病指數低于0.7。Zhan等[10]在2020年從江蘇、安徽和河南省的病鴿中鑒定出7株PPMV-1毒株，其F蛋白切割位點序列是典型強毒特征，但根據雞胚最小致死量的平均死亡時間（MDT）和腦內致病指數（ICPI）值分析，這7 株毒株屬于中等毒力。裴育等[14]從北京、天津、山東鴿群分離的4 株鴿NDV F 蛋白切割位點序列是典型強毒特征，但對雞的致病性顯示出中等毒力。因此，進行鴿新城疫致病性分析時應結合其他毒力判定指標進行綜合判定。

目前，鑒于無鴿源新城疫疫苗的現狀，雞新城疫疫苗被廣泛應用于鴿新城疫預防。調查數據顯示，近年和田地區規模化養鴿場主要應用雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗（LaSota株+SZ株）、雞新城疫活疫苗（LaSota株）、雞新城疫活疫苗（CS2 株）、新城疫滅活疫苗、重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株）防控鴿新城疫，雞源新城疫疫苗在控制鴿新城疫暴發流行中發揮了重要作用。本研究中，基于F基因的核苷酸同源性分析結果顯示，6 株新疆鴿NDV流行株與基因Ⅱ型的疫苗株核苷酸同源性為83.5%～84.7%，與基因Ⅲ型Mukteswarz株同源性為84.9%～85.7%。結果表明，基因型不匹配的新城疫疫苗對鴿子的臨床保護力有限，不能解決新城疫病毒脫落的缺點；在這種情況下，田間病毒仍可在鴿群中傳播并引起鴿新城疫呈點狀散發的流行特點。有研究報道，并非所有鴿子來源的病毒對雞的毒力均很低，鴿子病毒在家禽中的持續傳播可導致產生對家禽具有毒性的毒株，分離自孟加拉國的鴿子來源的NDV基因型ⅩⅪ.1.2對雞的致死率很高[15]。因此，規模化養鴿場需要定期進行血清學與病原學監測并結合監測結果制定相應的免疫程序，同時還需加強養鴿場飼養管理及消毒管理，以達到有效防控鴿新城疫的目標。

4 結論

本研究結果顯示，和田地區鴿NDV 基因型與我國鴿群中主要流行的NDV基因型Ⅵ的特征相符，6株F蛋白主要功能區均發生了點突變，且裂解位點序列具備強毒特征，但這些突變是否會影響病毒的致病性還需進一步研究加以證實。綜上所述，加強鴿新城疫流行病學調查，掌握鴿新城疫病毒分子特征，對養鴿業及養雞業的健康發展具有積極意義。