響應(yīng)面法優(yōu)化核桃分心木總黃酮提取工藝研究

劉 靜，葉朋飛，張春艷，黃慧福

（1.曲靖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南曲靖 655011；2.曲靖師范學(xué)院，云南曲靖 655011）

0 引言

核桃是胡桃科、胡桃屬的一種植物，我國(guó)是世界核桃生產(chǎn)大國(guó)，擁有最大的種植面積和產(chǎn)量。分心木為其副產(chǎn)物，是胡桃科核桃屬植物核桃的果核內(nèi)木質(zhì)隔膜，顏色呈棕色至淺棕褐色，又稱核桃隔膜[1-4]。分心木，體輕、質(zhì)脆、易折斷，呈薄片狀，約占核桃總質(zhì)量的4%～5%[5-6]。核桃分心木具有味澀、性平的特點(diǎn)，能夠入脾胃，對(duì)腎虛遺精[7]、口腔潰瘍[8]、牙齦出血[9]、失眠[10]等癥狀有療效，兼具藥食兩用價(jià)值。此外，核桃分心木還具抑菌[11]、抗氧化[12]、降血糖[13]、抑制腦功能衰退[14]、抗腫瘤[15]等作用。

云南核桃栽培歷史悠久，云南省16 個(gè)地、州市，129 個(gè)縣、市、區(qū)均有分布及栽培。核桃產(chǎn)業(yè)是云南省發(fā)展高原特色農(nóng)業(yè)中的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，種植面積全國(guó)第一，占43%。核桃是木本一種油料樹(shù)種，綜合利用經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，在脫貧致富的道路上發(fā)揮了巨大作用。每加工1 000 kg的核桃，就產(chǎn)生50 kg的核桃分心木副產(chǎn)物被當(dāng)作廢棄物處理，造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)。核桃分心木富含黃酮[16-17]、多酚[18]、多糖[19]等多種活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物在核桃分心木中含量較高，且具有光譜藥理活性，無(wú)毒無(wú)害[20]，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，關(guān)于核桃分心木黃酮提取方法的研究較少，采用超聲輔助提取法能使植物中的成分更好地溶出，相較于傳統(tǒng)的提取工藝，提取率更高[21]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃，購(gòu)自保山市；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度：HPLC≥98%），成都麥德生科技有限公司提供；無(wú)水乙醇（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供；氫氧化鈉（AR），西隴化工股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV5100 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，安徽皖儀科技股份有限公司產(chǎn)品；CR-060S 型超聲波清洗器，深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TDL5A 型離心機(jī)，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮提取工藝

核桃分心木于50 ℃下烘干，粉碎、過(guò)篩，備用。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 核桃分心木粉末，按照一定的液料比，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在超聲波輔助條件下提取一定的時(shí)間，采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定分心木提取液中總黃酮的吸光度[22]。

1.3.2 總黃酮得率的計(jì)算

（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。配制質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液備用。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液0.5 mL，搖勻、放置6 min 后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH 溶液4 mL 快速定容搖勻，靜置15 min 后，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定總黃酮提取液的吸光度。以吸光度（A） 為因變量，蘆丁溶液質(zhì)量濃度（C） 為自變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

（2） 總黃酮含量的測(cè)定。取待測(cè)液1 mL，按

1.3.2（1） 的方法測(cè)定，同時(shí)做空白，核桃分心木中總黃酮的提取率按下式計(jì)算：

式中：C——提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V0——樣品提取液體積，mL；

V1——提取液樣品測(cè)定定容體積，mL；

V2——測(cè)定用樣液體積，mL；

M——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1） 料液比對(duì)提取率的影響。選取料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL），在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲溫度為40 ℃的條件下提取40 min，分析料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

（2） 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。選取超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min，在料液比為1 ∶50（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，超聲溫度為40 ℃的條件下，分析超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

（3） 超聲溫度對(duì)提取率的影響。選取超聲溫度為20，30，40，50，60 ℃，在料液比為1∶50（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，超聲時(shí)間為50 min 條件下，分析超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

（4） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響。選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%，30%，40%，50%，60%，在料液比為1∶50（g∶mL），超聲溫度為40 ℃，超聲時(shí)間為50 min 的條件下，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為自變量，以總黃酮的提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化核桃分心木總黃酮的提取工藝[24-25]。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

以吸光度為因變量，蘆丁溶液質(zhì)量濃度為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=12.799X-0.004 4，R2=0.999 8）。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳料液比的確定

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖1 可知，核桃分心木總黃酮的提取率隨著料液比的增加，先上升后下降，是因?yàn)榱弦罕鹊脑黾釉龃罅撕颂曳中哪究傸S酮的溶解力，使得提取率增大。當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，核桃分心木中非黃酮類物質(zhì)溶出，導(dǎo)致提取率下降[26]。因此，料液比選擇為1∶50（g∶mL）。

2.2.2 最佳超聲時(shí)間的確定

超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2 可知，超聲時(shí)間對(duì)總黃酮的提取率有一定的影響，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮的提取率在50 min 之前逐漸增加，之后提取率下降。因此，超聲時(shí)間選擇為50 min。

2.2.3 最佳超聲溫度的確定

超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖3 可知，總黃酮的提取率隨溫度的升高先上升后下降，在40 ℃提取率達(dá)到最大。可能是由于溫度的升高會(huì)破壞不穩(wěn)定的黃酮分子的結(jié)構(gòu)使得提取率下降[27]。因此，選擇40 ℃的超聲溫度為宜。

2.2.4 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖4 可知，總黃酮的提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%以前逐漸增加，之后提取下降。分析其原因?yàn)椋?dāng)體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，部分醇溶性雜質(zhì)會(huì)被溶出，以致于總黃酮的提取率下降。因此，選擇40%的乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以核桃分心木總黃酮的提取率為響應(yīng)值，通過(guò)Design Expert 8.0 對(duì)表2 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得擬合方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 方差分析

方差分析見(jiàn)表3。

表3 方差分析

由表3 可知，模型的p＜0.000 1，失擬項(xiàng)p值為0.050 7 不顯著，模型的決定系數(shù)R2為0.961 7，說(shuō)明可以利用該方程確定核桃分心木總黃酮提取率的最佳工藝參數(shù)。各因素對(duì)核桃分心木總黃酮提取率的影響順序?yàn)镈＞A＞C＞B。

各參數(shù)之間的交互作用可由響應(yīng)面法中的三維空間曲面圖形象地反映出來(lái)。響應(yīng)面中的曲線越彎曲說(shuō)明研究因素對(duì)結(jié)果的影響越大。等高線呈現(xiàn)圓形時(shí)，說(shuō)明兩因素交互作用不顯著；等高線呈現(xiàn)橢圓時(shí)，兩因素交互作用顯著。

兩因素交互作用對(duì)總黃酮提取率的響應(yīng)面曲線和等高線圖見(jiàn)圖5。

圖5 兩因素交互作用對(duì)總黃酮提取率的響應(yīng)面曲線和等高線圖

由圖5 可知，A與B、A與C、A與D的等高線圖均趨于橢圓形，說(shuō)明交互作用顯著；B和C、B和D、C和D的等高線圖均趨于圓形，說(shuō)明交互作用不顯著。

2.4 最佳工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面分析軟件確定料液比1∶54（g∶mL），超聲時(shí)間50 min，超聲溫度41 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)43%為核桃分心木總黃酮工藝的最優(yōu)條件，總黃酮的提取率為7.87%。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得總黃酮的提取率為7.78%，與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明該模型可靠性強(qiáng)。

3 結(jié)論

超聲波輔助提取法經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，提取率高，且不會(huì)破壞有效成分，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮提取的最優(yōu)條件為料液比1∶54（g∶mL），超聲時(shí)間50 min，超聲溫度41 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)43%，總黃酮的提取率為7.78%。