閩北風(fēng)吹肉制成中微生物組成及多樣性變化

范 俐，秦鑫宇，周聰麟，李 力

（武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建南平 354300）

閩北風(fēng)吹肉（又稱閩北臘肉） 是以新鮮豬肉為原料，經(jīng)過腌制、風(fēng)干等多道工序加工而成，香氣濃郁、滋味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特而深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。風(fēng)吹肉因水分較少而限制了有害微生物的滋生，保存期較長(zhǎng)[2]。微生物發(fā)酵是影響風(fēng)吹肉制品成熟度、口感風(fēng)味的重要環(huán)節(jié)[3]。微生物對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物進(jìn)行降解[4-5]，形成酸、醛、酮、酯、次黃嘌呤、短肽等物質(zhì)，使臘肉制品呈現(xiàn)特殊的風(fēng)味。

通過從家庭作坊式生產(chǎn)的風(fēng)吹肉制品，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS），研究閩北風(fēng)吹肉風(fēng)干過程中微生物菌群組成及多樣性，查找影響風(fēng)味的關(guān)鍵菌群。HTS 可快速、準(zhǔn)確、全面地反映不同樣品中微生物群落的組成，鑒定一些低豐度及不可培養(yǎng)的微生物[7]，還可以提供實(shí)用的基因組成和相關(guān)分布[8]。董蘊(yùn)等人[9]基于變性梯度凝膠電泳和MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)綜合分析發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)臘肉中優(yōu)勢(shì)菌群主要是葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬和假交替單胞菌屬。周瑩等人[10]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同加工階段的徽派臘肉中微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)成熟中期和成熟結(jié)束的臘肉中主要優(yōu)勢(shì)菌為葡萄球菌、鹽弧菌和放線菌。李彥虎[11]分析陜西傳統(tǒng)臘肉制品中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)環(huán)絲菌屬、肉桿菌屬、乳桿菌屬等為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。目前，對(duì)閩北風(fēng)吹肉中微生物菌群的研究仍未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用自制傳統(tǒng)閩北風(fēng)吹肉進(jìn)行試驗(yàn)。以長(zhǎng)條新鮮凍豬肉（長(zhǎng)30～40 cm，寬3～5 cm），共12 條，約10 kg，在常溫潔凈水中浸泡解凍3 h，瀝干水分進(jìn)行腌制。

腌制原料及用量見表1。

表1 腌制原料及用量/g

將處理的豬肉條放進(jìn)鋁盆中，以白酒涂抹均勻，加入老抽均勻涂抹，最后將食鹽、白砂糖、十三香混合后倒入涂抹，揉搓15 min 左右，用保鮮膜封上盆口，放入4 ℃的冰箱中冷藏腌制4 d，腌制期間每隔1 d 翻一次肉，4 d 后用將肉掛在通風(fēng)良好，干凈衛(wèi)生的環(huán)境中風(fēng)干，風(fēng)干16 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

風(fēng)吹肉風(fēng)干期間，采集0，4，8，12，16 d 樣品（五平行），用無菌錫紙包裹，在裝入密封袋中，分別編號(hào)A，B，C，D，E，經(jīng)液氮冷凍后，存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 基因組DNA 抽提

風(fēng)吹肉樣品中總DNA 的抽取選用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），參照使用說明從樣品中提取DNA。使用Qubit 2.0 分光光度計(jì)定量DNA，并通過0.8% 瓊脂糖凝膠電泳確定DNA 提取的完整性。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

以稀釋后的基因組總DNA 為模板，靶向擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因，擴(kuò)增引物分別為27F/1492R。選用真菌特異性引物ITS1/ITS2 對(duì)ITS 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)采用3 份（3 個(gè)平行） 20 μL 的混合液，其中包括5×FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、2 個(gè)引物（5 μmol/L） 各0.8 μL、0.4 μL FastPfu 聚合酶、10 ng 的模板DNA、補(bǔ)水至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性為95 ℃，5 min，然后95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，45 s，共27 個(gè)循環(huán)，72 ℃退火10 min，于4 ℃條件下保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司） 切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)及建庫。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用UPARSE version 7.1（http：//drive5.com/uparse/） 以98.65%的相似性截?cái)嘀祵?duì)OTU 進(jìn)行聚類，利用UCHIME 識(shí)別并刪除嵌合序列。采用RDP 分類器（http：//rdp Classifier） 分析各16S rRNA 基因序列與Silva（SSU132） 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，置信閾值為70%。擴(kuò)增子測(cè)序由上海百澤龍生物技術(shù)有限公司完成。使用Biozeron 云平臺(tái)（http：//www.cloud.biomicroclass.com/CloudPlatform） 對(duì)微生物進(jìn)行α 多樣性和β 多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

按照98.65% 相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列） 進(jìn)行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，生成OTU 表格。

細(xì)菌和真菌高通量測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 細(xì)菌和真菌高通量測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)/個(gè)

根據(jù)表2 可知，細(xì)菌中共獲得7 870 個(gè)OTUs，涵蓋16 個(gè)門，217 個(gè)屬，683 個(gè)種；真菌中共獲得5 957 個(gè)OTUs，涵蓋3 個(gè)門，97 個(gè)屬，189 個(gè)種。

樣品中細(xì)菌（a） 和真菌（b） 群落共享和獨(dú)有的OTU 的韋恩圖分析見圖1。

圖1 樣品中細(xì)菌（a） 和真菌（b） 群落共享和獨(dú)有的OTU 的韋恩圖分析

由圖1 可知，各時(shí)期樣品中細(xì)菌（a） 和真菌（b） 群落共享和獨(dú)有的OTU 數(shù)目不同，說明不同時(shí)期樣品中微生物分類有明顯差異。

2.2 不同風(fēng)干時(shí)期臘肉中微生物群落α 多樣性分析

臘肉樣品細(xì)菌（a） 和真菌（b） 群落α 多樣性見表3。

表3 臘肉樣品細(xì)菌（a） 和真菌（b） 群落α 多樣性（a） 細(xì)菌

由表3（a） 可知，細(xì)菌中Chao1 和ACE 指數(shù)在風(fēng)干A，B，C 期不斷增大，說明在這3 個(gè)時(shí)期里，風(fēng)吹肉中細(xì)菌數(shù)目和種類在不斷增加；D 時(shí)期有所降低，E 時(shí)期指數(shù)又增大，可能E 時(shí)期一些耐鹽菌恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖。Shannon 和Simpson 指數(shù)在A，B，E時(shí)期顯著升高說明此時(shí)物種的豐度和均勻度很高。

由表3（B） 可知，真菌中Chao1，ACE，Shannon 和Simpson 指數(shù)與細(xì)菌中的變化相似，A，B，C，E 時(shí)期指數(shù)增大，說明風(fēng)吹肉中真菌豐度和均勻度在提高，但總體低于細(xì)菌豐度和均勻度，與OTU 數(shù)據(jù)表結(jié)論一致。

（b） 真菌

2.3 樣品中基于屬水平的菌群組成

對(duì)風(fēng)吹肉微生物中主要優(yōu)勢(shì)菌屬（前20 位） 進(jìn)行分析。

臘肉樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（a） 和真菌（b） 菌屬（前20） 及其在樣品中的相對(duì)豐度見表4。

表4 臘肉樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（a） 和真菌（b） 菌屬（前20）及其在樣品中的相對(duì)豐度（a） 細(xì)菌

由表4 可知，細(xì)菌群落共檢測(cè)出16 個(gè)門類，其中放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在屬水平上，相對(duì)豐度大于1%的主要優(yōu)勢(shì)菌為放線菌（36.5%）、葡萄球菌屬（27.2%）、羅河桿菌屬（8.1%）、嗜冷桿菌屬（6.7%）、沉積物桿狀菌屬（6.1%）、考克氏菌屬（3.4%）、弗蘭克氏菌屬（1.6%）、短根瘤菌屬（1.6%）。這結(jié)論與母雨等人[12]研究結(jié)果相同，即盤縣火腿中發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬；有些研究表明魏斯氏菌屬（0.27%）、巨球菌屬（0.26%）、乳球菌屬（0.18%） 是臘肉發(fā)酵中重要菌屬[7，13]，但在研究中其含量較少，可能因環(huán)境及風(fēng)干天數(shù)不同的條件影響。

真菌群落中共檢測(cè)出3 個(gè)門類，排名前20 的菌屬分屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門，在屬水平上，相對(duì)豐度大于1%的主要優(yōu)勢(shì)菌為德巴利氏酵母屬（68.9%）、Kurtzmaniella（11.6%）、紅酵母屬（9.9%）、鐮刀菌屬（2.0%）、念珠菌屬（2.0%）、交鏈孢屬（1.3%），表明酵母菌為主要優(yōu)勢(shì)真菌，酵母菌屬于兼性菌，在發(fā)酵時(shí)可吸收掉殘存氧氣，從而能夠抑制臘肉氧化酸敗，能阻止有害微生物的滋生，還對(duì)臘肉風(fēng)味的形成有促進(jìn)作用[14-17]。

（b） 真菌

2.4 優(yōu)勢(shì)菌在屬水平上的群落演替

為了揭示各時(shí)期樣品中菌群豐度變化和群落動(dòng)態(tài)演替規(guī)律，基于屬分類水平，將樣品中細(xì)菌和真菌相對(duì)豐度＞1%的菌群繪制微生物群落分布柱形圖。

不同時(shí)期臘肉樣品中的細(xì)菌（a） 和真菌（b）物種分布見圖2。

圖2 不同時(shí)期臘肉樣品中的細(xì)菌（a） 和真菌（b） 物種分布

由圖2（a） 可知，在各時(shí)期的風(fēng)吹肉樣品中細(xì)菌群落演替比較明顯。葡萄球菌屬在風(fēng)干的A 時(shí)期僅為0.6%，B 時(shí)期相對(duì)豐度達(dá)到42.6%，E 時(shí)期為31.0%；羅河桿菌屬在A 時(shí)期樣品中的相對(duì)豐度為25.6%，在B，C，D 這3 個(gè)時(shí)期中不斷降低。說明葡萄球菌屬、羅河桿菌屬在風(fēng)吹肉生產(chǎn)早期（1～4 d）有重要作用。

風(fēng)干各時(shí)期中的真菌群落動(dòng)態(tài)演替具有很強(qiáng)的可比性。由圖2（b） 可知，A 時(shí)期群落多樣性最大，B，C，D 期在不斷減少，與前面Shannon 和Simpson指數(shù)相一致。其中，德巴利氏酵母菌屬A 時(shí)期最低14.7%，D 時(shí)期最高90.1%，德巴利氏酵母菌可促進(jìn)高級(jí)醇、乙酸酯和脂肪酸酯的生成[18]。Kurtzmaniella和紅酵母屬在整個(gè)過程中呈現(xiàn)出不規(guī)則的變化；A時(shí)期的鐮刀菌屬相對(duì)豐度為12.7%、念珠菌屬為7.5%、交鏈孢屬為8.0%，在后期風(fēng)干過程中逐漸降低為零，可能與風(fēng)吹肉含水量降低和鹽分相對(duì)增加相關(guān)。

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序分析對(duì)閩北風(fēng)吹肉中微生物多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，風(fēng)吹肉中細(xì)菌共獲得7 870 個(gè)OTUs，涵蓋16 個(gè)門，217 個(gè)屬，683 個(gè)種；真菌共獲得5 957 個(gè)OTUs，涵蓋3 個(gè)門，97 個(gè)屬，189 個(gè)種。在5 個(gè)不同的風(fēng)干時(shí)期都有各自獨(dú)有的OTU，揭示了不同時(shí)期微生物群落的多樣性。

風(fēng)吹肉中的細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門；優(yōu)勢(shì)菌屬為放線菌屬（Actinomycetia unclassified）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、羅河桿菌屬（Rhodanobacter） 以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）；真菌主要優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門和擔(dān)子菌門；優(yōu)勢(shì)菌屬為德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、Kurtzmaniella及紅酵母屬（Rhodotorula）。從門水平和屬水平來看，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌種多于真菌，α 多樣性也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的群落多樣性優(yōu)于真菌，說明細(xì)菌在風(fēng)吹發(fā)酵過程中比真菌發(fā)揮更重要的作用。