廣東省市售靈芝及相關制品中靈芝總三萜含量監測結果分析

姚 敬，黃偉雄，龍朝陽，邵義娟，朱 盼，李 暉

（廣東省疾病預防控制中心，廣東 廣州 511430）

靈芝屬于擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，靈芝菌科，靈芝屬[1]，是《本草綱目》中唯一被收錄五經的藥材，具有較高的藥用價值[2]。靈芝孢子是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌褶中彈射出的極其微小的卵形生殖細胞即靈芝的種子，是活體生物體，雙壁結構，被堅硬的幾丁質纖維素所包圍，人體很難充分吸收，因此需要破壁或者去壁處理，才能發揮靈芝孢子粉最大的營養價值[3]。

靈芝孢子油是以破壁靈芝孢子粉經二氧化碳超臨界萃取得到的脂溶性混合物，集成了靈芝孢子的多種活性成分[4]。隨著對靈芝不斷深入的科學研究，發現靈芝、靈芝孢子粉及靈芝孢子油化學成分復雜，主要包含三萜、甾體、多糖、生物堿、脂肪酸等多種化學成分[5-7]。

在各種活性化學成分當中，靈芝三萜由于其良好的藥理活性，已逐漸引起人們的關注和重視，其中靈芝三萜類化合物在抗腫瘤方面的研究一直是靈芝藥理研究的重點[8]。除了抗癌性外，研究還表明靈芝三萜類化合物在抗菌[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]、保護神經元[12]、保肝護肝[13]、降血糖[14]等方面具有較好的作用，但現階段針對靈芝不同部位、不同生長階段、破壁與未破壁孢子粉、靈芝孢子油的營養品質等方面的綜合研究不多。

鑒于靈芝三萜具有多種藥理活性，研究靈芝總三萜含量可作為評價靈芝藥用價值的一個重要指標，采用科學測定方法確定靈芝中靈芝總三萜含量，對于建立靈芝質量標準、規范靈芝市場以及推動靈芝產業發展具有重要意義。

目前，我國規定的靈芝及靈芝孢子粉、孢子油等相關制品中總三萜測定方法及評價標準主要有《中國藥典（2020 年版）》[15]、GH/T 1335—2021《靈芝孢子粉》[16]等，測定方法大致相同，其中區別主要在于提取溶劑及選取的對照品。

考慮到最終結果的可比性，研究采用統一的比色法系統地測定廣東銷售的靈芝及相關制品中靈芝總三萜含量，采用科學的方法對靈芝不同部位、不同生長階段、破壁與未破壁孢子粉、靈芝孢子油中總三萜含量進行分析比較，為人群選擇相關產品提供了參考數據，也為今后靈芝及相關制品的質量評價提供參考指標，并為其藥理活性研究提供理論基礎與試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

齊墩果酸對照品，大連美侖meilunbio（＞98%），lot：D0701AS，CAS：508-02-01；香草醛：香蘭素，CNW，＞98%，CAS：121-33-5，lot：E324K024。其他試劑：乙醇、乙酸乙酯、高氯酸、甲醇、冰醋酸，均為分析純，廣州試劑廠提供。

樣品來源：根據廣東省衛生健康委辦公室印發《廣東省開展鐵皮石斛等3 種按照傳統既是視頻又是中藥材物質專項風險監測實施方案》的通知，采樣點選擇在廣州、珠海、佛山、韶關、梅州、東莞、中山、江門、湛江、云浮共10 個地市轄區范圍內的超市、藥房、農貿市場、種植基地等居民主要采購地點。按照實施方案中簡單隨機抽樣的方法，采集靈芝、靈芝孢子粉（包含破壁與未破壁）、靈芝孢子油3 類樣品，其中所采集的破壁靈芝孢子粉均包裝標稱符合GB 29344—2012 《靈芝孢子粉采收及加工技術規范》要求，破壁靈芝孢子粉破壁率不得小于95%[17]。

1.2 儀器與設備

島津UV-2660 型紫外分光光度計、Mettler Toledo ML204 型電子天平天平、Branson 2510 型超聲波振蕩器。

1.3 測定方法

最終結果需要在同一測定方法下得出才具有可比性，因此采用了適用于基質最為復雜、總三萜提取難度最大的靈芝的《中國藥典（2020 年版）》中規定的總三萜測定方法分別對所采集到的靈芝及靈芝孢子粉、孢子油等相關制品中總三萜進行測定，并統一以齊墩果酸（C30H48O3） 作為對照品。具體步驟如下：

（1） 精密稱取樣品粉末或殘渣狀2 g，置于錐形瓶中，加入乙醇溶液50 mL，超聲處理45 min，過濾，濾液置于100 mL 容量瓶中，用乙醇溶液分次洗滌濾渣，洗液并入容量瓶中，加入乙醇溶液定容至刻度，搖勻。

（2） 精密量取樣品溶液0.2 mL，置于10 mL比色管中，揮干后加入香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置于冰水浴中冷卻5 min，取出，加入乙酸乙酯4 mL，搖勻后使用紫外分光光度計于波長546 nm 處測定吸光度。

（3） 標準曲線的配制：精密稱取齊墩果酸（C30H48O3） 對照品（cas：508-02-1，＞98%） 0.016 2 g，加甲醇溶液定容至100 mL 容量瓶，配制成質量濃度為0.159 mg/mL 的標準溶液。

（4） 再精密量取對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 分別置于10 mL 比色管中，自上述“揮干”起與樣品管同法操作，測定吸光度。

（5） 紫外分光光度計測定從標準曲線上讀出樣品液中齊墩果酸的含量，計算即得[15]。

1.4 評價標準

未破壁靈芝孢子粉是未進行人工破壁，人體很難充分吸收，僅是作為生產靈芝孢子粉產品的原料或中間物料而非最終產品，不適用于GH/T 1335—2021《靈芝孢子粉》中規定的適用范圍，因此在研究中靈芝及未破壁靈芝孢子粉中總三萜參考《中國藥典（2020 年版）》規定：以干燥品計算，含三萜及甾醇不得少于0.50%[15]。破壁孢子粉及孢子油中總三萜參考GH/T 1335—2021《靈芝孢子粉》規定：總三萜均應大于等于2%[16]。

1.5 數據處理方法

用Excel 建立數據庫，用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 靈芝及相關制品總三萜含量的檢測情況

在廣東地區采集了125 份靈芝及相關制品，總三萜含量為0.22%～29.4%，均值和中位值分別為3.11%和1.37%，其中低于《中國藥典（2020 年版）》或GH/T 1335—2021《靈芝孢子粉》規定的有1 份靈芝樣品和1 份靈芝孢子粉樣品，總體不及格率為1.6%。

靈芝及相關制品總三萜含量見表1。

表1 靈芝及相關制品總三萜含量

對各類靈芝及相關制品總三萜含量進行單因素方差分析（ANOVA），方差齊性檢驗的p值為0，小于0.01，說明3 組方差不齊，因此采用非參數分析的獨立樣本Kruskal-Wallis 檢除進行各組間兩兩比較，各組間的調整顯著性均小于0.05，說明各類靈芝及相關制品總三萜含量間具有顯著的統計性差異。

靈芝及相關制品總三萜含量的Kruskal-wallis 檢驗結果見表2。

表2 靈芝及相關制品總三萜含量的Kruskal-Wallis 檢驗結果

2.2 靈芝不同部位中總三萜含量的檢測情況

在研究中，靈芝不同部位具體分為靈芝子實體（全只）、菌蓋（靈芝片）、未破壁靈芝孢子粉，其中有一份靈芝子實體（全只） 和一份未破壁靈芝孢子粉的總三萜含量低于《中國藥典（2020 年版）》規定的0.5%。

靈芝不同部位中總三萜含量見表3。

表3 靈芝不同部位中總三萜含量

對靈芝不同部位中總三萜含量進行單因素方差分析（ANOVA），方差齊性檢驗的p值為0，小于0.01，說明3 組方差不齊，因此采用非參數分析的獨立樣本Kruskal-wallis 檢除進行各組間兩兩比較，靈芝子實體- 菌蓋間的調整顯著性為0.873，靈芝子實體- 未破壁靈芝孢子粉和菌蓋- 未破壁靈芝孢子粉間的調整顯著性均小于0.05，說明靈芝子實體與菌蓋間的總三萜含量沒有顯著性差異，未破壁靈芝孢子粉中總三萜含量與另外兩者間具有顯著的統計性差異。

靈芝及相關制品總三萜含量的Kruskal-Wallis 檢驗結果見表4。

表4 靈芝及相關制品總三萜含量的Kruskal-Wallis 檢驗結果

2.3 不同生長階段子實體中總三萜含量的檢測情況

靈芝子實體的不同階段分為菌蕾期（剛長出菌袋切口的幼嫩靈芝）、成熟期（成熟但未彈粉的子實體）、彈粉期（開始彈粉后的子實體），其中有1 份菌蕾期子實體的總三萜含量低于《中國藥典（2020年版）》規定的0.5%。

不同生長階段子實體中總三萜含量見表5。

表5 不同生長階段子實體中總三萜含量

對不同生長階段子實體中總三萜含量進行單因素方差分析（ANOVA），方差齊性檢驗的p值為0.372，大于0.01，說明3 組方差齊性；單因素方差分析結果的p值為0.135，大于0.01，說明3 組結果無顯著性差異。

2.4 不同靈芝孢子粉中總三萜含量的檢測情況

在廣東地區合計采集了45 份靈芝孢子粉，總三萜的含量在0.22%～3.85%，均值和中位值分別為2.70%和3.23%。在采集的靈芝孢子粉中，未破壁靈芝孢子粉的總三萜的含量均值和中位值分別為1.72%和1.53%，破壁靈芝孢子粉均值和中位值分別為3.42%和3.49%，且未破壁靈芝孢子粉中有1 份樣品的總三萜含量低于《中國藥典（2020 年版）》規定的0.5%。

未破壁與破壁靈芝孢子粉中總三萜含量見表6。2 種靈芝的總三萜含量間的差異采用獨立樣本t檢驗進行分析，方差齊性檢驗中顯著性p值為0.001，小于0.05，說明2 組數據方差齊性，從均值檢驗中查看顯著性p值（雙側） 為0，小于0.05，未破壁與破壁靈芝孢子粉中總三萜含量具有顯著性差異。

表6 未破壁與破壁靈芝孢子粉中總三萜含量

3 結論

研究結果顯示，廣東市售的各類靈芝及相關制品中總三萜含量基本符合《中國藥典（2020 年版）》或GH/T 1335—2021《靈芝孢子粉》的規定，不合格率僅為1.6%。不同種類間的靈芝及制品中總三萜含量具有顯著性的差異：靈芝中總三萜含量低于靈芝孢子粉，而遠低于靈芝孢子油。

通過對靈芝不同部位的總三萜含量進行統計分析可知，靈芝子實體和菌蓋的總三萜含量并無顯著性差異，但均低于未破壁靈芝孢子粉的總三萜含量。而柳小蘭等人[18]指出，靈芝子實體（整支） 和靈芝孢子粉（未破壁） 間總三萜含量無顯著差異，此結果與本試驗有一定差異，推測與靈芝品種、栽培方法、栽培環境等因素有關。

通過對不同生長階段的靈芝子實體的總三萜含量進行分析可知，子實體不同生長階段三萜含量間呈顯著性差異，含量比較穩定，各生長階段間差異不大。針對孢子粉破壁與否的對比分析可知，破壁靈芝孢子粉的總三萜含量更高，表明破壁技術對靈芝營養成分含量有很大影響，與前人的研究結果相符[19-20]。

綜上所述，廣東銷售的靈芝及其制品中總三萜含量基本都符合相關要求。作為人體攝入靈芝總三萜的來源，靈芝子實體和靈芝片無明顯差異。若在經濟條件允許的條件下，靈芝孢子粉和靈芝孢子油是補充靈芝總三萜的更好選擇，其中破壁靈芝孢子粉的效果要優于未破壁靈芝孢子粉。