低共熔溶劑提取澳洲堅果青皮多酚工藝優化研究

黃寶玲，陳海彬，李詠梅，唐泳鈺，李佳純，葉婉苑

（廣東科貿職業學院，廣東廣州 510430）

澳洲堅果又名夏威夷果、澳洲核桃等，因味美營養高，被譽為“堅果之王”[1]；其果實由果仁、果殼和青皮組成，可食用部位果仁在澳洲堅果占比17%，被廣泛應用于即食型干果產品、澳洲堅果油、澳洲堅果乳飲料等[2]。青皮是堅果加工的主要副產物，占澳洲堅果鮮果質量的45%～60%，除極少量用于漚肥或飼料，絕大部分被丟棄，造成了極大的浪費。近年來，有較多學者意識到澳洲堅果青皮的潛在的保健、藥用價值，已開展部分研究工作。郭剛軍等人[3]采用80%乙醇超聲提取澳洲堅果青皮，并用不同極性溶劑對其提取物進行分步萃取。結果表明，乙酸乙酯提取物含有較高含量的總酚和黃酮，正丁醇提取物提取多糖效果較好。張明等人[4]同樣以乙醇為提取溶劑，通過超聲輔助方式對澳洲堅果青皮的總酚提取進行工藝優化。結果表明，當乙醇體積分數為30%，料液比為1∶50（g∶mL），超聲溫度70 ℃，超聲功率250 W，超聲時間24 min 時，總酚提取效果最佳，可達（1 836.21±32.51） mg/100 g，該結果為澳洲堅果青皮生物活性成分的開發利用奠定了基礎。

提取多酚的傳統方法常以有機溶劑為介質，存在費時、生產能耗高、活性組分易損失、得率低等不足。近年來，環境友好的低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs） 備受關注[5]。DESs 是由氫鍵供體和氫鍵受體組成的2 個組分或3 組分低共熔混合物，具有熔點低、無毒、成本低、生物可降解性等良好特性[6]。通過改變DESs 的組成成分、摩爾比、水分添加量等因素，可使DESs 的理化性質發生變化，從而影響其對生物活性成分的提取。目前，已有較多研究表明低共熔溶劑法在植物活性成分提取中具有卓越的提取能力。孫悅等人[7]采用超聲輔助低共熔溶劑法探究DESs 體系（組成組分、摩爾比、水分添加量） 與提取方式（料液比、提取溫度、超聲時間及超聲功率） 對甘草多糖提取率的影響。結果顯示，甘草多糖提取劑選擇摩爾比1∶3，水分添加量40%的氯化膽堿- 異丙醇體系時，多糖提取率較好。并且在該提取溶劑下，改變提取方式優化甘草多糖提取工藝后，提取率可達8.31%。李杰等人[8]以氯化膽堿- 乙二醇- 水組成的低共熔溶劑（DESs）為提取溶劑，采用單因素試驗和Box-behnken 響應面法對超聲輔助DESs 提取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷進行了優化。結果表明，優化后的工藝對3 種黃酮類成分的總提取率為20.78%。王曉藝等人[9]同樣采用超聲輔助低共熔溶劑方法對玫瑰多酚進行提取工藝優化，通過與傳統乙醇提取溶劑相比發現，低共熔溶劑具有較強的多酚提取能力，提取量較乙醇相比提高了24%。

為了解低共熔溶劑對澳洲堅果青皮多酚提取的規律，采用澳洲堅果青皮為試驗材料，分別選擇價廉易得、生物活性成分提取能力較好的氯化膽堿、1.3- 丁二醇為氫鍵供體與氫鍵受體，組成氯化膽堿- 1.3 丁二醇體系，創新性地通過超聲輔助低共熔溶劑法提取澳洲堅果青皮中的多酚，優化出綠色環保高效的提取方式，為澳洲堅果青皮資源化利用提供有價值的參考依據，促進澳洲堅果產業可持續發展。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

澳洲堅果青皮、氯化膽堿、乳酸、沒食子酸標準品、福林酚、碳酸鈉、無水乙醇。

UC-9000 型超聲波清洗儀，深圳朗杰超聲電器有限公司產品；UV3000 型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產品；FA124 型萬分電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；TG16-WS 型離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 青皮多酚提取

青皮多酚提取流程：澳洲堅果青皮粉末→加入低共熔溶劑攪拌→混勻→超聲輔助提取→離心→上清液。

1.2.2 低共熔溶劑配制

稱量一定量的氯化膽堿與1.3 - 丁二醇，按照摩爾比1∶3 比例混合，置于80 ℃水浴中溶解，配制成100%的低共熔溶劑，冷卻待用。

1.2.3 單因素試驗設計

（1） DESs 體積分數對青皮多酚提取的影響。準確稱取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入體積分數為0，12.5%，25%，50%，75%，100%的DESs 30 mL，用玻璃棒輕輕攪拌，在40 ℃條件下，用40 kHz 超聲輔助提取30 min，將得到的粗提液以轉速8 000 r/min 離心10 min，上清液待用。平行3 次試驗。

（2） 料液比對青皮多酚提取的影響。準確稱取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入體積分數為50%的DESs，配制料液比為1∶20，1∶60，1∶100，1∶140，1∶180，1∶220，用玻璃棒輕輕攪拌，在40 ℃條件下，用40 kHz 超聲輔助提取30 min，將得到的粗提液以轉速8 000 r/min 離心10 min，上清液待用。平行3 次試驗。

（3） 提取時間對青皮多酚提取的影響。準確稱取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入體積分數為50%的DESs 30 mL，用玻璃棒輕輕攪拌，在40 ℃、40 kHz 超聲輔助條件下，分別提取10，30，50，70，90 min，將得到的粗提液以轉速8 000 r/min 離心10 min，上清液待用。平行3 次試驗。

1.2.4 沒食子酸標曲的繪制

參照Pantelidis G E 等人[10]的方法測定沒食子酸的標準曲線。準確稱取一定質量沒食子酸標準品，用無水乙醇配置10，20，40，60，80 μg/mL 的沒食子酸標準溶液。分別吸取1 mL 不同質量濃度的沒食子酸標準溶液，加入去離子水1 mL 和體積分數為10%的福林酚試劑5 mL，搖勻，靜置反應5 min，加入質量分數為7.5%的碳酸鈉溶液2 mL，用去離子水定容至10 mL，在避光條件靜置1 h，以水為參比，測定反應液在波長765 nm 下的吸光度（A）。以沒食子酸標準溶液質量濃度（C） 為橫坐標，吸光度（A） 為縱坐標，做出沒食子酸標準曲線。

1.2.5 青皮多酚提取量測定

用待測的青皮多酚上清液代替沒食子酸標準溶液，測定吸光度，再代入標準曲線中，按照公式計算多酚提取量。

式中：C——上清液中多酚質量濃度，μg/mL；

V——上清液的體積，mL；

N——容量瓶量程，mL；

W——青皮粉末的質量，g；

M——提取液取液量，mL。

1.2.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，分別對DESs 體積分數、料液比、提取時間3 個因素取三水平設計因素水平表，進行L9（33）正交試驗。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.2.7 數據處理與分析

試驗數據與表格采用Excel 軟件進行統計分析，試驗圖繪制采用Gragh Pad 軟件。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的建立

以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到的沒食子酸標準曲線的回歸方程Y=0.012 5X+0.114 2，R2=0.999。由圖1 可知，沒食子酸質量濃度為0～100 μg/mL 與吸光度線性關系良好。

圖1 沒食子酸標準曲線

沒食子酸標準曲線見圖1。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 DESs 體積分數對青皮多酚提取的影響

DESs 體積分數對多酚提取量的影響見圖2。

圖2 DESs 體積分數對多酚提取量的影響

由圖2 可知，青皮多酚提取量隨著DESs 的體積分數呈現先增加后降低的趨勢。當DESs 的體積分數為0～50%時，多酚提取量隨著DESs 的體積分數增加而增加；當DESs 的體積分數為50～100%時，多酚提取量隨著DESs 的體積分數增加而降低。主要的原因是：①DESs 可在常溫下形成廣泛的氫鍵網絡，使其具有高黏度的特征，體積分數較高時，DESs 黏度過大時限制有效成分的提取；②DESs 中加入一定量水后，離子水之間形成的氫鍵可降低DESs 的黏度，提高從固體到液體的傳質速率。另外，多酚類物質是帶有多個羥基的極性物質，水的加入可增加DESs 的極性，使DESs 的極性趨近于青皮多酚極性，促進多酚類物質的溶解。但DESs 體積分數過小時，水量添加過多可能破壞體系中的氫鍵，影響多酚類物質與DESs 的氫鍵作用，從而造成多酚類物質提取量降低。綜合考慮，DESs 的體積分數宜為50%，此時多酚提取量最高，為287.16 mg/100 g。

2.2.2 料液比對青皮多酚提取的影響

料液比對多酚提取量的影響見圖3。

圖3 料液比對多酚提取量的影響

多酚類物質提取過程中，物料與溶劑的比例對提取量有很大影響。由圖3 可知，當青皮粉與DESs料液比小于1∶140 時，多酚提取量隨著料液比的增大而提高。可能是因為隨著DESs 添加量增多，青皮粉與DESs 之間的接觸面積增大的同時，增大了兩者之間的濃度差，增強青皮多酚類物質向DESs 擴散的傳質推動力，提高提取率。當青皮粉與DESs 料液比為1∶140 時，多酚提取量達到最大。當料液比大于1∶140，DESs 趨于飽和時，多酚提取量隨著料液比的增大而降低，可能是因為當料液比過大時，多糖、果膠、可溶性蛋白等物質的溶出影響了多酚類物質的溶解，使多酚提取量降低。綜合考慮，選擇1∶140 為最佳料液比。

2.2.3 提取時間對青皮多酚提取的影響

提取時間對多酚提取量的影響見圖4。

由圖4 可知，在10～50 min 內，隨著提取時間的延長，青皮中多酚提取量呈增長態勢。50 min 后，多酚提取量略有變化，但差異不明顯。因為超聲的空化作用能夠使青皮粉中的細胞發生破裂，釋放出多酚類物質。在初始階段，提取時間較短，多酚提取不完全，提取量低；延長提取時間能夠增加DESs與青皮粉之間的傳質，提取量增加；50 min 后，提取過程接近于固液平衡，擴散速度降低，多酚提取量沒有顯著性增加。同時，超聲過長可能會破壞多酚物質，提取時間為90 min 時多酚類物質略有下降。綜合考慮，選擇50 min 為最佳提取時間。

2.3 正交試驗結果與分析

正交試驗結果見表2，正交試驗方差分析見表3。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

以多酚提取量為考查指標，對提取工藝進行優選。由表2 可知，各因素對多酚提取效果的影響主次為料液比（A） ＞提取時間（C） ＞體積分數（B）。由表3 可知，料液比對青皮多酚提取量影響顯著（p＜0.05）。數據顯示，超聲輔助低共熔溶劑提取青皮多酚最優工藝條件為A3B1C3，即料液比1∶160，體積分數40%，提取時間60 min。

3 結論

采用超聲輔助低共熔溶劑提取澳洲堅果青皮中多酚類物質。在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平的正交試驗方法優化青皮多酚的最佳提取工藝。試驗得到最優提取工藝參數為料液比為1∶140，低共熔溶劑體積分數40%，超聲提取時間60 min，此條件下多酚得率為439.64 mg/g，提取量優于前人報道結果，說明低共熔溶劑具有良好的多酚提取能力。

不僅為澳洲堅果加工產業處理青皮等副產物資源化、高值化的綜合利用提供了數據支撐，也為多酚、黃酮等生物活性成分提供了一種高效綠色環保的提取方法，在功能性食品領域上具有廣闊的應用前景。