圈養條件下新疆馬鹿兩個亞種的腸道菌群比較分析

徐尚華, 吳家慧, 張寶峰, 石明慧, 王一晨, 胡 昕, 胡德夫*

(1.北京林業大學 生態與自然保護學院,北京 100083;2.北京動物園 圈養野生動物技術北京市重點實驗室,北京 100044)

馬鹿(Cervuselaphus)為鹿科大型獸類,廣泛分布于歐亞大陸北部森林帶,存在眾多亞種,在我國均為國家二級重點保護動物。天山馬鹿(Cervuselaphussongaricus)見于我國及哈薩克斯坦的天山森林帶,具有耐嚴寒及適應能力強等特點[1]。塔里木馬鹿(Cervuselaphusyarkandensis)僅見于我國新疆塔里木河流域的胡楊林,是我國特有的馬鹿亞種,具有耐炎熱干燥、耐粗飼、抗病能力強等特點[2]。馬鹿是重要的藥用動物,具有很高的經濟價值,在我國新疆,天山馬鹿和塔里木馬鹿都有規模化的飼養種群。腸道菌群是指生活在宿主體內復雜且處于動態平衡的微生物群落[3],是處理食物的關鍵[4],從而影響宿主能量的獲取和儲存,進而影響宿主的健康、免疫、代謝等功能[5-6]。許多研究人員對鹿類動物(如麋鹿、馬鹿等)的腸道菌群進行了研究,發現厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在腸道菌群中占主導地位[7-9]。大量證據表明菌群穩定是腸道穩態的基礎,菌群的失調易導致消化道疾病。例如,志賀氏菌(Escherichia-Shigella)和梭桿菌屬(Fusobacterium)豐度的顯著升高會導致林麝腹瀉[10],梭桿菌門(Fusobacteria)豐度的顯著上升會導致羔羊腹瀉[11],早期腸道菌群的失調可能是導致鴕鳥幼鳥高死亡率的重要原因[12],人體腸道內正常細菌與致病菌的比例失調可能是宿主腸道發生炎癥的觸發點[13]。迄今天山馬鹿腸道菌群鮮有研究,而塔里木馬鹿菌群的研究主要集中在瘤胃微生物。研究表明,普雷沃式菌屬(Prevotella)是塔里木馬鹿瘤胃內的優勢菌屬,是瘤胃中最豐富的菌屬之一,表現出遺傳多樣性和代謝多樣性,該菌屬所含有的活性半纖維素降解酶在植物纖維的分解中發揮著潛在的作用[14-15]。然而天山馬鹿與塔里木馬鹿的腸道菌群組成至今仍不明確。本研究通過16S rRNA基因測序技術對圈養天山馬鹿與塔里木馬鹿的腸道菌群進行比較分析,旨在了解兩種馬鹿亞種腸道菌群的核心菌群、微生物組成以及多樣性,獲得馬鹿種群的基礎菌群數據,為兩種馬鹿亞種間腸道菌群的差異,以及我國馬鹿養殖業的發展和鹿場飼養管理的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2021年10月分別于新疆烏魯木齊天山馬鹿養殖中心和新疆庫爾勒塔里木馬鹿養殖中心選取年齡、體型相近的健康成年雄性馬鹿各7只,用耳標區分每只馬鹿個體。天山馬鹿及塔里木馬鹿的食物組成按《馬鹿飼養技術》[16]和《馬鹿的養殖技術》[17]的飼料配比:精飼料玉米30%,豆餅(油渣)20%,糠麩50%,鈣30～40 g,鹽20～30 g;粗飼料為干草、野草、農作物莖葉及苜蓿等。

1.1.2 主要試劑與儀器設備 MN NucleoSpin?96 Soil試劑盒(德國 MACHEREY-NAGEL公司);Qubit dsDNA HS測定試劑盒(美國 Life Technologies公司);E.Z.N.A. Gel &PCR Clean Up Kit試劑盒(美國 OMEGA公司);Monarch DNA Gel Extraction Kit試劑盒(美國 NEB公司);KOD FX Neo酶(上海東洋紡管理有限公司)。微型離心機(1795,北京天根生化科技有限公司);振蕩器(G560E,美國 SI公司);96 well PCR儀(9902,美國 ABI公司);24孔離心機(5424EQ766751,德國 Eppendorf公司);高速離心機(Legend Micro 21,德國 Eppendorf公司);真空泵(ZK-26/100,杭州米歐儀器有限公司);酶標儀(SynergyHTX,香港基因有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 每日6:30(北京時間)進入圈舍采集新鮮糞便樣本。觀察個體排便后,迅速使用無菌乳膠手套收集放入自封袋中,密封后記錄采集日期、耳標等信息,并立即保存于液氮中運送回實驗室,-80 ℃冷凍保存直至提取DNA。新疆庫爾勒天山馬鹿簡稱CES(C.e.songaricus),新疆烏魯木齊塔里木馬鹿簡稱CEY(C.e.yarkandensis)。

1.2.2 DNA提取、16S rRNA基因擴增和測序 使用MN NucleoSpin 96 Soil提取細菌DNA。通過Qubit dsDNA HS測定試劑盒測量DNA的濃度和純度。使用引物 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)從14份糞便樣本中擴增出細菌16S rRNA基因的V3～V4區。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)體積為10 μL,包含5 μL KOD FX Neo Buffer,0.2 μL KOD FX Neo,2 μL dNTP,10 μmol/L正向和反向引物各0.3 μL,50 ng基因組DNA,其余體積為ddH2O。PCR條件:95 ℃持續5 min,然后進行25個循環,分別為95 ℃持續30 s,50 ℃持續30 s,72 ℃持續40 s和72 ℃持續7 min。PCR產物用OMEGA DNA 純化柱進行過濾柱純化。最終,在Biomarker Technologies Corporation(中國北京)進行Illumina HiSeq 2500平臺(Illumina,Inc.,圣地亞哥,美國加利福尼亞)的高通量測序。

1.2.3 生物信息學分析 對原始數據進行拼接(FLASH,version 1.2.11),將拼接得到的序列進行質量過濾(Trimmomatic,version 0.33),并去除嵌合體(UCHIME,version 8.1),得到高質量的 Tags 序列。在相似性97%的水平上對序列進行聚類(USEARCH,version 10.0),以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。細菌數據庫參考SILVA。在Mothur(version 1.30)軟件中計算得到的α多樣性指數,來表明細菌群落的豐富性和多樣性。α多樣性是指一個特定區域或者生態系統內的多樣性,常用的度量菌群豐度的指標有Chao1豐富度估計量(Chao1 richness estimator);度量菌群多樣性的指標有香農-威納多樣性指數(Shannon-wiener diversity index)、辛普森多樣性指數(Simpson diversity index)等,Simpson指數值越小,說明群落多樣性越高;Shannon指數越大,說明群落多樣性越高。β多樣性反映兩個種群間細菌群落的差異,使用加權和非加權unifrac距離度量進行計算。采用單向相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)來確定細菌群落之間的組間差異。使用R語言中的vegan包進行分析,使用python繪制ANOSIM分析圖。LefSe分析,即組間差異顯著物種分析(可以稱作生物標記物分析),采用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)來估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小,該分析主要用于在豐度上找到組間有顯著差異的物種(LDA>4.0 為差異顯著)。

1.2.4 統計分析 應用SPSS 21.0軟件對數據進行獨立樣本t檢驗,數據結果以均值±標準差表示,P≤0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 測序水平

從7頭天山馬鹿與7頭塔里木馬鹿的糞便樣本中共獲得516 902個有效序列,單個樣本的序列為27 361～46 487(平均36 921.57±1 681.75),平均長度為(418.07±0.85) bp。在97%的序列相似性水平共鑒定出617個OTU,樣本的平均OTU個數為455.21±8.61(范圍:414～529,圖1A)。檢測到的OTU的稀疏曲線,隨著測序深度的增加,觀察到的物種數量也在增加(圖1B)。最終,曲線開始趨于平穩,表明隨著提取序列數量的增加,檢測到的OTU數量減少。

圖1 天山馬鹿和塔里木馬鹿糞樣OTU數目圖(A)和稀釋性曲線(B)Fig.1 OTU number diagram(A) and rarefaction curves (B) of fecal samples from Tianshan red deer and Tarim red deer

韋恩圖和花瓣圖顯示了天山馬鹿和塔里木馬鹿糞樣中共有和獨有的分類單元,兩組中所有個體共有的細菌類群被視為馬鹿腸道中的核心菌群。兩組馬鹿糞樣中共有579個OTU,天山馬鹿獨有25個OTU,塔里木馬鹿則獨有13個OTU(圖2A),共享OTU占天山馬鹿的95.86%;占塔里木馬鹿的97.80%。天山馬鹿個體共有299個OTU,而塔里木馬鹿個體共有230個OTU(圖2B、C),其中天山馬鹿共有OTU占平均單個樣本所有OTU的比例(98.82%)高于塔里木馬鹿(96.99%)。利用微生物參考數據庫對OTU的代表序列進行比對歸類,可將檢測到的主要細菌歸類至14個門、22個綱、41個目、85個科、195個屬。

圖2 天山馬鹿和塔里木馬鹿糞樣韋恩圖和花瓣圖Fig.2 Venn plot and flower plot of fecal samples from Tianshan red deer and Tarim red deerA:韋恩圖;B:天山馬鹿花瓣圖;C:塔里木馬鹿花瓣圖A:Venn plot; B:Flower plot of Tianshan red deer; C:Flower plot of Tarim red deer

2.2 α多樣性分析

通過α多樣性計算,檢驗兩個亞種之間腸道菌群的差異,OTU反映物種的豐富程度,天山馬鹿與塔里木馬鹿兩個亞種之間存在著顯著的差異(圖3)。Chao1、Shannon和Simpson等指數均在天山馬鹿與塔里木馬鹿兩組之間存在顯著差異,天山馬鹿的腸道菌群多樣性顯著高于塔里木馬鹿。

圖3 天山馬鹿和塔里木馬鹿腸道菌群α多樣性分析Fig.3 α diversity analysis of Tianshan red deer and Tarim red deer*表示存在顯著差異*Idicates that there is a significant difference

2.3 β多樣性分析

使用QIIME軟件進行β多樣性分析,比較不同樣本在物種豐度分布的相似程度。β多樣性分析主要采用加權unifrac、 非加權unifrac算法計算樣本間的距離從而獲得樣本間的β值。非度量多維標度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)圖顯示,基于加權unifrac距離度量,樣本種群可清晰的聚類(圖4A),ANOSIM結果顯示天山馬鹿和塔里木馬鹿兩組微生物群落之間存在顯著差異 (R=0.423,P<0.05,圖4B);而基于非加權unifrac方法無法清晰地將兩組樣本種群區分開(圖4C),ANOSIM結果顯示天山馬鹿和塔里木馬鹿兩組微生物群落之間差異不顯著(R=0.141,P=0.058,圖4D)。

圖4 天山馬鹿和塔里木馬鹿腸道菌群β多樣性分析Fig.4 β diversity analysis of Tianshan red deer and Tarim red deerA:基于加權unifrac算法的NMDS分析;B:基于加權unifrac算法的相似性分析;C:基于非加權unifrac算法的NMDS分析;D:基于非加權unifrac算法的相似性分析A:NMDS analysis based on weighted unifrac;B:ANOSIM based on weighted unifrac;C:NMDS analysis based on unweighted unifrac;D:ANOSIM based on unweighted unifrac

2.4 不同分類水平優勢菌群組成分析

馬鹿的腸道優勢菌群在門水平上,兩組馬鹿的優勢菌門為厚壁菌門Firmicutes(CES:53.74%;CEY:53.95%)、放線菌門Actinobacteria(CES:7.99%;CEY:24.71%)、變形菌門Proteobacteria(CES:19.30%;CEY:12.60%)、擬桿菌門Bacteroidetes(CES:16.36%;CEY:7.47%)、螺旋體門Spirochaetes(CES:1.59%;CEY:0.77%)、髕骨細菌門Patescibacteria(CES:0.32%;CEY:0.24%)、疣微菌門Verrucomicrobia(CES:0.36%;CEY:0.10%)、藍藻菌門Cyanobacteria(CES:0.13%;CEY:0.06%)、綠彎菌門Chloroflexi(CES:0.10%;CEY:0.000 3%)、軟壁菌門Tenericutes(CES:0.01%;CEY:0.08%)(圖5 A、B)。

圖5 天山馬鹿和塔里木馬鹿腸道菌群組成圖Fig.5 Composition of intestinal microbiota of Tianshan red deer and Tarim red deer A: 兩組之間在門水平上的對比圖;B: 各樣本在門水平上的對比圖;C: 兩組之間在屬水平上的對比圖;D: 各樣本在屬水平上的對比圖A: Comparison at phylum level between two groups; B: Comparison of samples at phylum level; C: Comparison at genus level between two groups; D: Comparison of samples at genus level

在屬水平上,兩組馬鹿的優勢菌為不動桿菌屬Acinetobacter(CES:10.47%;CEY:10.48%)、雙歧桿菌屬Bifidobacterium(CES:0.59%;CEY:17.37%)、森林土源芽胞桿菌屬Solibacillus(CES:12.71%;CEY:4.80%)、狹義梭菌屬1Clostridiumsensustricto1(CES:2.08%;CEY:9.07%)、瘤胃球菌科UCG菌屬RuminococcaceaeUCG005(CES:5.66%;CEY:4.57%)、索氏梭菌屬Paeniclostridium(CES:6.27%;CEY:3.93%)、羅斯氏菌屬Romboutsia(CES:3.70%;CEY:5.41%)、理研菌科RC9腸道菌群RikenellaceaeRC9gutgroup(CES:5.47%;CEY:2.20%)、蘇黎氏菌屬Turicibacter(CES:0.75%;CEY:5.82%)、節桿菌屬Arthrobacter(CES:1.65%;CEY:4.87%)(圖5C、D)。

2.5 菌群差異分析

通過LEfSe分析(圖6),天山馬鹿和塔里木馬鹿腸道中有24個菌群存在差異。塔里木馬鹿Actinobacteria、RuminococcaceaeUCG014的相對豐度顯著高于天山馬鹿;天山馬鹿Proteobacteria、Bacteroidetes、類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、RikenellaceaeRC9gutgroup、Solibacillus、Acinetobacter的相對豐度顯著高于塔里木馬鹿。

圖6 天山馬鹿和塔里木馬鹿腸道菌群LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis about intestinal microbiota of Tianshan red deer and Tarim red deerA:進化分支圖;B:LDA值分布柱狀圖(LDA>4.0)A:Cladogram diagram; B:LDA value distribution histogram (LDA>4.0)

3 討 論

本研究采用16S rRNA基因測序技術首次對比分析天山馬鹿與塔里木馬鹿兩個馬鹿亞種腸道菌群。OTU稀疏曲線(圖1B)表明本研究測序數據充足,能夠體現樣本中的絕大部分物種。韋恩圖和花瓣圖表明兩個馬鹿亞種共享OTU占天山馬鹿的95.86%,占塔里木馬鹿的97.80%。一項關于羊亞科三個不同屬的研究結果表明,三個屬之間共享OTU達74%以上[18]。這表明近源的反芻動物共享相似的核心菌群[19]。

此外,天山馬鹿的共有OTU占平均單個樣本所有OTU的比例高于塔里木馬鹿,且α多樣性指數比較顯示(圖3),天山馬鹿菌群多樣性和豐度顯著高于塔里木馬鹿。研究者普遍認為,健康的腸道菌群系統具有細菌多樣性和豐度高的特點,具備更高的結構穩定性和抵抗力[20-21]。因此天山馬鹿腸道菌群結構穩定性高于塔里木馬鹿,同一飼養條件下天山馬鹿腸道抵抗力和恢復力更高,塔里木馬鹿更易罹患消化道疾病。另一方面,樣本之間的差異也表明菌群結構的復雜性,這與不同品種的羊的菌群結構具有顯著差異的研究結果一致[22]。

β多樣性結果顯示馬鹿亞種間的差異不顯著(非加權的unifrac距離結果顯示P=0.058>0.05)。基于非加權unifrac方法分析,主要比較物種的有無,若兩個群體的β多樣性距離越小,則物種類型越相似。這表明天山馬鹿所具有的菌群種類與塔里木馬鹿基本相同,僅是豐度存在差異,即在相同飼養條件下,天山馬鹿與塔里木馬鹿腸道菌群的基本結構一致。推測其菌群之間的差異源自于長期生活在不同環境下所產生的亞種間菌群的適應性變化。自然狀態下天山馬鹿的生存環境為山地森林和林間草地[23],食源植物種類較多,包括雪嶺云杉、禾本類植物、莎草科植物、苜蓿和苔蘚植物等;而塔里木馬鹿的生存環境為荒漠河岸林[24],較為干燥,主要食物為蘆葦、脹果甘草及胡楊等。因此,天山馬鹿腸道菌群的高多樣性可能是在適應中保留下來的。

天山馬鹿和塔里木馬鹿菌群結構中優勢菌門包括厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門,與前人研究一致[25]。其中厚壁菌門和擬桿菌門被認為是反芻動物的核心菌門,與馬鹿[26]、黇鹿[27]、麋鹿[7]等研究一致。厚壁菌門是主要的纖維素分解細菌,可以將纖維素分解為揮發性脂肪酸,供宿主使用[28]。擬桿菌門可降解碳水化合物和蛋白質,參與腸道免疫調節[29]。二者在粗纖維消化過程中發揮著重要作用,因此在馬鹿及其他草食動物腸道菌群中處于優勢地位[30]。此外,厚壁菌門與擬桿菌門比值(F/B ratio)是研究腸道菌群的重要指標,與腸道菌群從食物中提取能量的效率成正比[18,31]。天山馬鹿擬桿菌門豐度顯著高于塔里木馬鹿,F/B比值(3.28)小于塔里木馬鹿(7.22),表明塔里木馬鹿腸道菌群從食物中獲取能量的效率高于天山馬鹿。這可能是由于塔里木馬鹿從環境中攝取的食物相比天山馬鹿較為粗糙,所含能量較少,所以其腸道菌群需從相對較少的資源中獲取盡可能多的能量,從而滿足自身及宿主的能量需求。同時有研究表明,高淀粉飲食可提高擬桿菌門的豐度[29]。因此,可適當提高塔里木馬鹿的精飼料比例,促進擬桿菌門的富集。

放線菌門是維持腸道屏障穩態的必要參與者,在維持腸道穩態中起著關鍵作用,可發酵碳水化合物并產生短鏈脂肪酸,為機體提供能量。放線菌門產生的脂肪酸經一定反應后形成的鹽(如乙酸鹽等)可以保護宿主免受腸道病原體(如腸出血性大腸埃希菌、志賀氏菌)感染[32],在免疫系統中起著至關重要的作用。塔里木馬鹿腸道中的放線菌門豐度顯著高于天山馬鹿,且放線菌門下的雙歧桿菌屬也高于天山馬鹿。有研究表明宿主雙歧桿菌豐度在高纖維食物條件下會顯著升高,在高脂肪食物條件下豐度下降[33-34]。這意味著對天山馬鹿而言,目前飼料中的粗飼料水平還有待提升。

變形菌門對木質素的消化起著重要作用[35]。因此在以植物纖維為主的飼養環境下,變形菌門在天山馬鹿和塔里木馬鹿的腸道菌群中占有優勢地位。本研究中,天山馬鹿腸道中變形菌門豐度顯著高于塔里木馬鹿。有研究表明,攝入高脂高蛋白食物的宿主腸道菌群中,變形菌門相對豐度高[36],這可能意味著目前圈養馬鹿的飼料配方對天山馬鹿來說精飼料比例過高(所飼精飼料含玉米淀粉、豆粕及麩皮等),應適當降低精飼料配比。

在屬水平上,二者共同優勢菌屬為不動桿菌屬。該菌屬部分細菌為條件致病菌,在環境中廣泛分布,是醫院內感染主要原因,對公共衛生具有重要意義[37]。也有研究表明,該菌具有代謝多樣性,可降解己內酰胺、除草劑、有機磷農藥和多種石油烴組分等[38]。推測不動桿菌屬的優勢地位可能源自飼料中的農藥殘留或者是從環境中攝入。本研究中,天山馬鹿腸道中不動桿菌屬豐度顯著高于塔里木馬鹿。該菌高豐度表明在之后的飼養管理中需要關注動物身體狀況,否則在罹患消化道疾病時該菌很可能會導致病情的惡化。

此外,塔里木馬鹿的RuminococcaceaeUCG014相對豐度高于天山馬鹿。Ruminococcaceae屬于厚壁菌門,該科的細菌可將植物細胞壁分解成營養基質,供其他微生物利用[19,39-41]。這表明塔里木馬鹿在分解植物細胞壁獲得的能力強于天山馬鹿,在同等食物條件下,塔里木馬鹿可獲取更高的能效。

天山馬鹿的理研菌科RC9(RikenellaceaeRC9gutgroup)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、Solibacillus相對豐度高于塔里木馬鹿。理研菌科RC9的高豐度可能與脂質代謝有關[42]。類芽胞桿菌屬可以為食草動物和植物抵御病原體(細菌、真菌、線蟲和病毒)侵襲,還可合成多種酶,包括淀粉酶、纖維素酶等,輔助分解飼料中的碳水化合物;另一方面,它還是條件性致病菌[43],當宿主腸道穩態失衡時可能作為致病菌促進病程發展。這與上述推測飼料中精飼料配比過高的結論一致,同時更應關注天山馬鹿健康狀況。Solibacillus在病變及瘤胃酸中毒的條件下會減少[44-45],目前被認為是有益菌。有益菌豐度也會影響腸道穩態的動態平衡,這提示需更多關注塔里木馬鹿的消化狀況。

圈養條件下,塔里木馬鹿腸道菌群多樣性低于天山馬鹿,天山馬鹿腸道中的條件性致病菌(不動桿菌屬、類芽胞桿菌屬)相對豐度較高,均不利于腸道菌群的穩定及健康。針對二者不同的菌群組成,認為在現有基礎上,可適當減少天山馬鹿的精飼料配比,提高塔里木馬鹿的精飼料配比,以求改善二者的菌群組成。

本研究通過描述圈養天山馬鹿及塔里木馬鹿的腸道優勢微生物種群,旨在了解不同馬鹿亞種腸道微生物組成差異,闡明其腸道菌群的組成及結構,為兩個亞種間腸道菌群的差異提供參考,為檢測天山馬鹿及塔里木馬鹿腸道菌群的健康狀況提供依據。這些信息為改善圈養馬鹿健康飼養管理提供重要依據,為圈養馬鹿的腸道菌群健康穩定以及將來進一步為重要野生動物的管理保護提供參考。