結(jié)核分枝桿菌Rv0081基因編碼蛋白的生物信息學分析

楊雨婷, 楊國平,2*

(1.大理大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院醫(yī)學微生物學及免疫學教研室,云南 大理 671000;2. 大理大學 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室,云南 大理 671000)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的危害人類健康的慢性傳染病,是全球十大致死原因之一。WHO最新結(jié)核病流行病學報告指出,每年約有1 000萬人感染Mtb,140萬人死于結(jié)核病,且全球約有17億人口為Mtb潛伏感染者[1-5]。近年來,由于HIV合并感染、耐藥菌株的產(chǎn)生及卡介苗預(yù)防效果不佳等原因,結(jié)核病的發(fā)病率明顯上升,結(jié)核病的防治面臨著巨大挑戰(zhàn)。因此,開發(fā)安全、高效的新型結(jié)核疫苗對控制Mtb在全球范圍內(nèi)的流行具有重要意義。以蛋白抗原表位為基礎(chǔ)合成的多肽疫苗可通過提供大量特異性抗原精確啟動高效的保護性體液免疫和細胞免疫,且易于生產(chǎn)、儲存,產(chǎn)生的副作用較小[6-10]。因此,對Mtb蛋白的抗原表位進行預(yù)測,并對所預(yù)測結(jié)果進行綜合分析從而篩選出優(yōu)勢抗原表位,將為新型結(jié)核疫苗的研制奠定堅實的理論基礎(chǔ)。Mtb休眠生存調(diào)節(jié)因子(Dormancy survival regulator,DosR)通過調(diào)節(jié)約48個休眠相關(guān)基因的表達而使Mtb進入休眠狀態(tài),與Mtb潛伏感染密切相關(guān)[11]。Rv0081基因是DosR調(diào)節(jié)系統(tǒng)中一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其編碼的Rv0081蛋白參與Mtb在低氧等應(yīng)激條件下的存活,是Mtb進入休眠狀態(tài)的標志性抗原[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),Rv0081蛋白可通過促進全血細胞分泌干擾素(Interferon, IFN)-γ、白介素(Interleukin, IL)-12p70等細胞因子啟動機體的適應(yīng)性免疫反應(yīng),還可促進全血細胞分泌具有抗菌效應(yīng)的促炎因子如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)-α、IL-6等發(fā)揮抗Mtb感染作用[14-15],表明該蛋白具有一定的免疫原性,有可能成為預(yù)防及診斷Mtb潛伏感染的潛在靶點。本研究應(yīng)用多種生物信息學分析軟件對Mtb Rv0081蛋白的生物學特征及抗原表位進行預(yù)測,為今后深入系統(tǒng)的分析Rv0081蛋白的免疫特性及研發(fā)新型結(jié)核疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Rv0081蛋白的生物信息學分析所用分析軟件及網(wǎng)址見表1。

表1 Rv0081蛋白的生物信息學分析相關(guān)軟件Table 1 Software related to bioinformatics analysis of Rv0081 protein

1.2 方法

1.2.1 Rv0081蛋白氨基酸序列的獲取 從NCBI網(wǎng)站獲取Mtb Rv0081蛋白的氨基酸序列(NC_000962.3),該蛋白含114個氨基酸。經(jīng)BLAST比對,該蛋白氨基酸序列與卡介苗菌株中的Rv0081蛋白氨基酸序列同源性為100%。

1.2.2 Rv0081蛋白的理化性質(zhì)分析 運用生物信息學分析軟件ExPASy中的ProtParam及ProtScale對蛋白的理化性質(zhì)如氨基酸數(shù)目、消光系數(shù)、等電點、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)及親疏水性進行分析。

1.2.3 跨膜區(qū)、信號肽及亞細胞定位預(yù)測 TMHMM、SignalP-5.0 Server預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)及信號肽,綜合運用softberry及WoLF PSORT分析蛋白的亞細胞定位。

1.2.4 Rv0081蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用SOPMA、DNAStar及SWISS-MODEL分別預(yù)測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Rv0081蛋白糖基化及磷酸化位點的預(yù)測 利用在線軟件NetNGlyc-1.0 Server及NetPhos 3.1 Server預(yù)測蛋白糖基化及磷酸化位點。

1.2.6 Rv0081蛋白抗原表位的預(yù)測分析 運用DNAstar預(yù)測蛋白的B細胞抗原表位,綜合分析蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、表面可及性、柔韌性及抗原指數(shù)篩選出優(yōu)勢B細胞抗原表位。運用SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、Net MHC pan 4.1 server預(yù)測蛋白的CTL細胞抗原表位, SYFPEITHI及Net MHCⅡpan 4.0 server預(yù)測蛋白的Th細胞抗原表位,綜合分析各軟件預(yù)測結(jié)果,篩選出評分均較高的氨基酸序列作為優(yōu)勢CTL及Th細胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rv0081蛋白的理化性質(zhì)生物信息學分析

結(jié)果顯示Rv0081蛋白分子式為C543H914N160-O163S2,相對分子質(zhì)量為12 356.32,理論等電點為8.12,主要由亮氨酸(15.8%)、丙氨酸(14.0%)及精氨酸(10.5%)組成。序列中帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)為(精氨酸+賴氨酸)16個,帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)為(天冬氨酸+谷氨酸)15個,原子總量為1 782,在A280處消光系數(shù)為2 980,不穩(wěn)定系數(shù)為39.12小于40,表明該蛋白在體外為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在哺乳動物體外半衰期為30 h,在酵母菌體內(nèi)半衰期>20 h,在大腸埃希菌體內(nèi)的半衰期>10 h,滿足原核表達系統(tǒng)的表達條件,可在體外誘導表達Rv0081蛋白。親疏水性預(yù)測結(jié)果顯示,該蛋白序列總平均親水性為 0.144,序列中位于35位的色氨酸(Ser)親水性最強,為-1.414,位于89位的丙氨酸(ALa)疏水性最強,為1.67,預(yù)測結(jié)果與TMPred基本一致,預(yù)測該蛋白為疏水性蛋白(圖1),提示該蛋白可能以包涵體形式存在于細菌裂解液中,后期可通過大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)對該蛋白存在形式進行驗證。

圖1 Rv0081蛋白的親疏水性分析Fig.1 Analysis of Hydrophilicity and hydrophobicity of Rv0081

2.2 Rv0081蛋白的跨膜區(qū)、信號肽及亞細胞定位

使用TMHMM及SignalP-5.0 Server在線軟件分別對Rv0081蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽進行預(yù)測。結(jié)果顯示該蛋白具有胞內(nèi)域及胞外域兩個部分,無跨膜結(jié)構(gòu)(圖2A),無信號肽(圖2B),提示該蛋白屬于非分泌型蛋白,該蛋白進入宿主細胞發(fā)揮調(diào)控作用需借助非經(jīng)典途徑。綜合分析softberry及WoLFPSORT亞細胞定位預(yù)測結(jié)果,預(yù)測該蛋白存在于細胞質(zhì)中。

圖2 Rv0081蛋白跨膜區(qū)及信號肽Fig.2 Prediction of Rv0081 transmembrane and signal peptideA:Rv0081蛋白跨膜區(qū)預(yù)測;B:Rv0081蛋白信號肽預(yù)測A:The prediction of the transmembrane region of the Rv0081 protein; B:The prediction of the signal peptide of the Rv0081 protein

2.3 Rv0081蛋白結(jié)構(gòu)分析

運用SOPMA、DNAStar、SWISS-MODEL對Rv0081蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,結(jié)果顯示Rv0081蛋白的二級結(jié)構(gòu)由74個α-螺旋(64.91%)、9個β-轉(zhuǎn)角(7.89%)、21個無規(guī)則卷曲(18.42%)及10個延伸鏈(8.77%)構(gòu)成(圖3),與DNAStar預(yù)測結(jié)果基本一致;三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白含有大量的α-螺旋及無規(guī)則卷曲(圖4),與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。由于α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲易于扭曲、折疊,較易形成與B細胞表面受體(BCR)嵌合的結(jié)構(gòu),而該蛋白存在較多上述結(jié)構(gòu),提示該蛋白可能存在較多B細胞抗原表位。

2.4 Rv0081蛋白糖基化及磷酸化位點分析

蛋白的糖基化及磷酸化修飾是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,可通過影響蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)、疏水性、構(gòu)象及穩(wěn)定性而影響其功能。NetNGlyc-1.0分析結(jié)果顯示,Rv0081蛋白在第50位有一個糖基化位點(圖5A);NetPhos 3.1 Server分析結(jié)果顯示,Rv0081蛋白共存在7個氨基酸磷酸化位點,其中含6個絲氨酸磷酸化位點及1個酪氨酸磷酸化位點(圖5B),提示該蛋白可能參與細胞間的信號轉(zhuǎn)導從而調(diào)控宿主細胞的功能。

2.5 與Rv0081相互作用蛋白的預(yù)測

運用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測能與Rv0081相互作用的蛋白,結(jié)果顯示與Rv0081相互作用的10個蛋白評分從高到低為hycE、hycP、Rv0088、Rv0083、hycD、hycQ、Rv0082、devR、Rv0080、Rv0079(圖6)。通過分析Rv0081的相互作用蛋白,預(yù)測Rv0081蛋白可通過與Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)-2結(jié)合刺激巨噬細胞和外周血單核細胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-8等細胞因子,參與肉芽腫的形成及維持,減少Mtb的生長,從而控制Mtb在機體內(nèi)的復制及傳播;此外,該蛋白還可能與抑制蛋白質(zhì)合成有關(guān)并參與氧化還原反應(yīng)。提示該蛋白可能能增強巨噬細胞的抗菌效應(yīng),可作為研發(fā)新型多肽疫苗的候選抗原。

圖6 Rv0081蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Rv0081 protein interaction networks

2.6 Rv0081蛋白抗原表位預(yù)測

抗原表位是抗原分子上能與T、B細胞特異性結(jié)合并刺激其產(chǎn)生能特異性識別該抗原的致敏淋巴細胞及抗體的免疫活性區(qū),對蛋白抗原表位進行深入研究并篩選出優(yōu)勢抗原表位,對研發(fā)新型結(jié)核疫苗及開發(fā)高效診斷試劑具有重要意義。本研究運用DNAStar、SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、NetMHC pan 4.1 Server、NetMHCⅡpan 4.0 Server等生物信息分析軟件對RV0081蛋白T、B細胞抗原表位進行預(yù)測,綜合分析后篩選出優(yōu)勢抗原表位。

2.6.1 B細胞抗原表位預(yù)測 DNAStar 分析結(jié)果顯示,Rv0081蛋白氨基酸存在于表面可能性較大的區(qū)域為1～7、9～10、30～35、48～52、66～70位氨基酸殘基,其余位置存在于蛋白表面可能性較小;蛋白柔韌性較大易與B細胞表面抗原受體結(jié)合,形成表位可能性較大的區(qū)域為5～10、32～54、67～70、105～106、107～111位氨基酸殘基;DNAStar預(yù)測該蛋白共有11個B細胞抗原表位:1～7、9～13、19～25、29～37、40～53、57～61、65～71、79～83、89～93、96～103、105～113位氨基酸殘基(圖7)。綜合分析Rv0081蛋白的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲)、親水性、柔韌性、表面可及性及抗原指數(shù)篩選出6個優(yōu)勢B細胞抗原表位:1～7、28～37、39～53、57～62、65～71、105～113位氨基酸殘基(表2),提示該蛋白可啟動機體的體液免疫反應(yīng)。

圖7 Rv0081蛋白B細胞抗原表位預(yù)測Fig.7 Prediction ofB cell epitope of Rv0081

表2 Rv0081蛋白優(yōu)勢B細胞抗原表位信息Table 2 Information dominant B cell epitope of Rv0081 protein

2.6.2 CTL細胞抗原表位預(yù)測 綜合分析多款軟件預(yù)測結(jié)果可以彌補不同軟件在預(yù)測過程中的缺陷,提高預(yù)測結(jié)果的準確性,因此本研究運用3種不同的CTL表位分析軟件預(yù)測Rv0081蛋白HLA-A2*0201、HLA-A3*0301、HLA-B7*0702三種類型的CTL抗原表位(表3),綜合分析三種預(yù)測結(jié)果后篩選出6個優(yōu)勢CTL細胞抗原表位(表4),提示該蛋白可啟動由CD8+T介導的CTL型細胞免疫反應(yīng)。

表3 Rv0081蛋白CTL細胞抗原表位預(yù)測Table 3 Prediction of CTL epitope of Rv0081

表4 Rv0081蛋白優(yōu)勢CTL細胞抗原表位信息Table 4 Information dominant CTL cell epitope of Rv0081 protein

2.6.3 Th細胞抗原表位預(yù)測 運用SYFPEITHI、NetMHC II pan 4.0 Server軟件預(yù)測Rv0081蛋白HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501限制性Th細胞表位(表5),篩選出NetMHC II pan 4.0 Server預(yù)測的強結(jié)合表位且SYFPEITHI得分較高的序列作為Th細胞優(yōu)勢抗原表位(表6),提示該蛋白可啟動由CD4+T介導的Th型細胞免疫反應(yīng)。

表5 Rv0081蛋白Th細胞抗原表位預(yù)測Table 5 Prediction of Th epitope of Rv0081

表6 Rv0081蛋白優(yōu)勢Th細胞抗原表位信息Table 6 Information dominant Th cell epitope of Rv0081 protein

3 討 論

由Mtb感染引起的結(jié)核病是嚴重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。目前全球約有1/4人口為Mtb潛伏感染者,其體內(nèi)潛伏期Mtb的重新激活是結(jié)核病的重要來源[5]。因此,識別潛在的Mtb潛伏相關(guān)抗原,以產(chǎn)生抵御潛伏期Mtb的保護性免疫反應(yīng),對于設(shè)計有效的新型結(jié)核疫苗至關(guān)重要。

生物信息學是由生物學、計算機科學、應(yīng)用數(shù)學等學科相互交叉融合而成的一門新興學科,基于生物信息學分析工具從全基因水平篩選具有保護性免疫反應(yīng)的候選抗原表位的反向疫苗學已被廣泛運用于新型多肽疫苗的研發(fā)[16-19]。本研究運用生物信息學技術(shù)對Mtb潛伏期相關(guān)抗原Rv0081蛋白的生物學特征及表面抗原進行預(yù)測。分析結(jié)果顯示,Rv0081蛋白為穩(wěn)定的疏水性蛋白、無跨膜區(qū)及信號肽,含有1個糖基化位點及7個磷酸化位點,提示該蛋白屬于非分泌型蛋白,可能參與細胞間的信號轉(zhuǎn)導;該蛋白能與hycE、hycP、Rv0088、Rv0083、hycD、hycQ、Rv0082、devR、Rv0080及Rv0079等蛋白產(chǎn)生相互作用,可能與抑制蛋白質(zhì)合成及氧化還原反應(yīng)有關(guān),還可通過與巨噬細胞和外周血單核細胞表面的TLR2結(jié)合刺激細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-8等細胞因子增強機體的抗Mtb感染作用;其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(64.91%)、β-轉(zhuǎn)角(7.89%)和無規(guī)則卷曲(18.42%)構(gòu)成,提示該蛋白可能含有較多能與B細胞表面受體相結(jié)合的抗原表位。表面可及性及柔韌性分析結(jié)果顯示,Rv0081蛋白中可能存在于蛋白表面、易發(fā)生扭曲和折疊的氨基酸序列較少,形成B細胞抗原表位的可能性較小。為提高表位預(yù)測的特異性、準確性和適用性,本研究綜合分析Rv0081蛋白的親水性、表面可及性、柔韌性、抗原指數(shù)及二級結(jié)構(gòu)并篩選出6個各軟件評分均較高且存在于無規(guī)則卷曲及β-轉(zhuǎn)角中的氨基酸序列作為B細胞優(yōu)勢抗原表位:1～7、28～37、39～53、57～62、65～71、105～113位氨基酸殘基。

Mtb屬于胞內(nèi)寄生菌,感染早期主要由CD4+T細胞介導的1型輔助性T細胞(T helper type 1,Th1)型免疫反應(yīng)發(fā)揮抗感染作用,感染晚期主要由CD8+T細胞和自然殺傷細胞發(fā)揮細胞毒作用殺滅吞噬Mtb的巨噬細胞,啟動由T細胞介導的適應(yīng)性免疫反應(yīng)是防御Mtb感染的重要途徑。研究表明,蛋白質(zhì)抗原不能通過其完整的分子發(fā)揮功能,而是通過其表位分子反映抗原特異性,T細胞表位是觸發(fā)表位特異性保護性T細胞免疫反應(yīng)的基礎(chǔ),也是研發(fā)和設(shè)計新型結(jié)核疫苗、診斷試劑和治療藥物的關(guān)鍵[11,20-23]。聯(lián)合應(yīng)用多個MHC限制性表位可誘導針對不同HLA基因位點的T細胞免疫反應(yīng),拓寬免疫反應(yīng)人群[24]。HLA-A2*0201、HLA-A3*0301、HLA-B7*0702是最常見的MHC-Ⅰ類分子[25-27],與蛋白表面抗原結(jié)合后啟動機體細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)型免疫反應(yīng)。本研究運用3種不同的CTL表位預(yù)測軟件對Rv0081蛋白的HLA-A2*0201、HLA-A3*0301、HLA-B7*0702表位進行預(yù)測,綜合分析各軟件預(yù)測結(jié)果后篩選出6個優(yōu)勢CTL細胞抗原表位:77～85、96～104、28～36、87～95、24～32、92～100位氨基酸殘基。HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101及HLA-DRB1*1501是最常見且研究較為廣泛的MHCⅡ類分子[28-30],與抗原表位結(jié)合后啟動Th1型免疫反應(yīng)。本研究運用SYFPEITHI、NetMHCⅡpan 4.0 預(yù)測Rv0081蛋白的Th細胞表位,綜合分析兩個軟件預(yù)測結(jié)果后篩選出評分均較高的序列作為優(yōu)勢抗原表位,共篩選出7個優(yōu)勢Th細胞抗原表位:71～85、10～24、55～69、98～112、10～24、83～97、82～96位氨基酸殘基。

本研究結(jié)果表明理論分子量為12 356.32的Rv0081蛋白為穩(wěn)定蛋白質(zhì),可在體外誘導表達,且含有多個潛在的B、T細胞抗原表位,其中28～37位氨基酸殘基為B細胞及CTL細胞共同優(yōu)勢抗原表位,55～69及98～112位氨基酸殘基為B細胞及Th細胞共同優(yōu)勢抗原表位,71～85、82～96、83～97位氨基酸殘基為Th細胞及CTL細胞共同優(yōu)勢抗原表位,以這些共同表位為基礎(chǔ)合成的多肽疫苗可同時啟動機體的體液免疫及細胞免疫,還可對不同感染階段的Mtb進行殺傷[31],從而更好地控制Mtb在體內(nèi)的存活。這些結(jié)果共同表明,Rv0081蛋白可作為研發(fā)預(yù)防潛伏期Mtb重新激活的新型結(jié)核疫苗的候選優(yōu)勢抗原。今后,將通過免疫實驗(如ELISA)進一步驗證所篩選出的優(yōu)勢抗原表位,為新型結(jié)核疫苗的研制提供參考。