不同信號肽對釀酒酵母蔗糖轉化酶Suc2分泌表達水平的影響

王天琦, 王碧瑩, 付 彤, 陳曉藝, 李憲臻, 楊 帆

(大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034)

燃料乙醇作為一種清潔的生物質(zhì)能源具有可再生及改善、保護生態(tài)環(huán)境的作用[1]。以甘蔗、玉米為原料生產(chǎn)乙醇因爭糧爭地問題發(fā)展受到限制[2]。而以纖維素為原料生產(chǎn)乙醇,由于其預處理方法成本較高造成工業(yè)化生產(chǎn)進程緩慢[3];研究發(fā)現(xiàn)富含菊糖的菊芋可以代替玉米淀粉生產(chǎn)乙醇,且每噸乙醇的生產(chǎn)成本是利用淀粉生產(chǎn)成本的70%[4]。菊糖是由D-呋喃果糖通過β-1,2糖苷鍵相連而成的多聚果糖[5]。目前,僅有少數(shù)幾種微生物可以利用菊糖生產(chǎn)乙醇,并且生產(chǎn)乙醇能力有限[6]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有其他菌株無法比擬的優(yōu)點,如產(chǎn)乙醇能力強、遺傳操作平臺成熟、抗逆性強、適合大規(guī)模生產(chǎn),是利用菊糖產(chǎn)乙醇的首選微生物[7]。目前,已有少數(shù)幾種釀酒酵母被證明能夠直接利用菊糖生產(chǎn)乙醇[8]。而蔗糖轉化酶Suc2是這些釀酒酵母中分解代謝菊糖的關鍵水解酶。有研究表明,隸屬于糖苷水解酶32家族(GH32)的蔗糖轉化酶Suc2具有菊糖外切酶活力,是這些釀酒酵母中分解代謝菊糖的關鍵水解酶[9-10]。Suc2能夠催化菊糖中β-呋喃果糖苷末端非還原性β-呋喃果糖苷殘基水解,釋放出的果糖可以轉化為1,6-二磷酸果糖進入糖酵解過程,隨后啟動厭氧發(fā)酵生成乙醇[8]。研究表明,釀酒酵母中蔗糖轉化酶表達水平直接影響其轉化菊糖產(chǎn)乙醇的效率[4]。因此,通過優(yōu)化分泌表達途徑來提高蔗糖轉化酶Suc2的分泌表達效率對于提高釀酒酵母發(fā)酵菊糖產(chǎn)乙醇的能力至關重要。利用釀酒酵母分泌信號肽增強重組蛋白分泌表達水平是目前最有效的策略之一[11]。分泌信號肽位于分泌蛋白的N端,由短鏈氨基酸組成,并分為三個不同的區(qū)域:1～5個氨基酸組成帶正電荷的N端;7～15個疏水氨基酸組成的H核心區(qū);3～7個能被信號肽酶切割的親水氨基酸組成的C端[12]。很多研究表明,使用合適的分泌信號肽對細胞外分泌蛋白的表達至關重要。Inokuma等[13]使用釀酒酵母信號肽spSED1將β-葡聚糖苷酶BGL1和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGII的細胞外活性提高至1.3倍和1.9倍,并且spSED1使畢赤酵母(Pichiapastoris)中BGL1的細胞外活性提高了1.6倍。Marten等[14]在釀酒酵母SYE2102中使用MFα的啟動子和分泌信號肽融合Suc2使其表達量顯著提高,并有效分泌至周質(zhì)空間中。研究表明,使用一些異源的分泌信號肽也會使目的蛋白的表達量顯著提高。Xiong等[15]在釀酒酵母中表達人體溶菌酶hLM時,利用人血清蛋白HSA的分泌信號肽可以很好的指導其分泌。此外,還有研究通過對信號肽進行序列優(yōu)化改造來實現(xiàn)蛋白質(zhì)分泌水平的提高[12]。Aza等[16]對信號肽spMFα中4個位點(Aα9D、Aα20T、Lα42S、Dα83E)進行突變,優(yōu)化后的spMFαopt使兩種漆酶PK2和APL的分泌水平相較于未優(yōu)化的spMFα分別提高了2倍和12倍。為了使Suc2更有效分泌到細胞外,選擇一種合適的分泌信號肽至關重要。對于不同的分泌信號肽,宿主菌株內(nèi)源的分泌信號肽是很有潛力的候選者,因為它們可以保證被宿主的分泌表達系統(tǒng)所識別。已有研究表明5種源自釀酒酵母內(nèi)源的分泌信號肽AGA2、EXG1、PLB1、PHO5和SCW11能夠有效介導釀酒酵母對不同蛋白的分泌[14,17]。另有研究表明,來自于畢赤酵母和解脂耶氏酵母的分泌信號肽DAN4、MSB2和PRO[18-20]能夠?qū)崿F(xiàn)多種外源蛋白的高效表達,如胰島素前體IP、真菌防御素Plectasin等[18]。此外,近期研究成果還對天然信號肽一級結構進行了優(yōu)化,構建了新型分泌信號肽MFαnat、MFαopt和HECH[14,16],這些序列均源自分泌蛋白或者質(zhì)膜表達的蛋白。由此,本研究選擇11種不同來源的分泌信號肽進行生物信息學的初步篩選及預測,隨后使用RF克隆(Restriction-free cloning)的策略[21]將不同的分泌信號肽與蔗糖轉化酶Suc2融合,對重組菌進行蛋白質(zhì)分泌水平、酶活力、分泌效率以及乙醇產(chǎn)量進行分析,期望獲得菊糖基乙醇高效生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒SaccharomycescerevisiaeBY4741、EscherichiacoliDH10B 獲贈于大連化學物理研究所趙宗寶研究員課題組。質(zhì)粒 pYC230-SUC2獲贈于中國科學院青島生物能源與過程研究所。本研究所構建的質(zhì)粒與重組菌株如表1所示。

表1 本實驗涉及的質(zhì)粒與重組菌株信息表Table 1 The list of strains and plasmids constructed in this study

1.1.2 主要試劑與儀器設備 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、D-山梨醇、ACTB、蛋白胨等購自上海生工生物工程股份有限公司; 酵母浸粉、瓊脂粉購自Oxoid公司; 氯化鈉、異丙醇、無水乙酸鈉、硫酸鎂等購自天津市科密歐化學試劑有限公司; GoldviewII核酸染料購自北京賽百盛生物工程公司; 菊糖購自上海藍季科技發(fā)展有限公司;ExTaq DNA 聚合酶、Prime STAR DNA 聚合酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶(SalⅠ、PstⅠ、XbaⅠ)等購自大連TaKaRa公司; 其他常規(guī)試劑均為分析純購自上海國藥集團。梯度PCR儀(6325,Eppendorf公司);電轉儀(Eporator,Eppendorf公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(ImageQuant LAS 4000,美國通用公司);微量分光光度計(Nanovue Plus,美國通用公司);紫外分光光度計(UV-5200,上海元析儀器有限公司);多功能酶標儀(F50,Tecan公司);數(shù)字式全自動壓力滅菌鍋(SX700,日本TOMY公司)。

1.2 方法

1.2.1 不同分泌信號肽序列的獲取與引物的合成 本研究選擇的釀酒酵母、解脂耶氏酵母和畢赤酵母的分泌信號肽序列,從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和SGD(https://www.yeastgenome.org/)獲取;人工合成及優(yōu)化改造的分泌信號肽序列從文獻中獲取[14-15];為了更好地構建重組載體,所有序列均添加了載體和蔗糖轉化酶Suc2的一部分,送至上海生工生物工程股份有限公司進行合成;擴增帶同源臂的不同信號肽序列所用引物使用Primer Premier 5設計,上游引物sp-F序列(5′-3′)為CATTCTCTTGTTCTTGTGC,下游引物sp-R序列(5′-3′)為CGGTGTCATTTGGGTTGTATTG,送至上海生工生物工程股份有限公司進行合成。

1.2.2 生物信息學分析方法 信號肽在線預測軟件SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);蛋白親疏水性預測軟件Ex PAsy在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/)。

1.2.3 不同分泌信號肽重組質(zhì)粒的構建及鑒定 使用引物sp-F和sp-R擴增1.2.1合成的片段,并使用膠回收試劑盒進行純化。通過RF克隆的方法,將質(zhì)粒pYC230-SUC2上Suc2的原始分泌信號肽替換為目的分泌信號肽。通過電擊轉化的方法將重組質(zhì)粒轉化至大腸埃希菌DH10B中,挑取長勢較好的單菌落進行菌落PCR(菌落PCR引物sp-F和sp-R)驗證,驗證正確后,送至吉林省庫美生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.4 不同分泌信號肽重組菌的構建與鑒定 將測序結果正確的重組質(zhì)粒電擊轉化至釀酒酵母BY4741,挑取長勢較好的單菌落接入YPD后,使用質(zhì)粒提取試劑盒提取釀酒酵母質(zhì)粒,通過電擊轉化的方法轉入大腸埃希菌DH10B中,挑取單菌落進行菌落PCR(菌落PCR引物sp-F和sp-R)驗證,驗證正確后,送至吉林省庫美生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.5 重組菌發(fā)酵培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法:從平板挑取重組菌1環(huán)接種至10 mL YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。取1 mL種子液接入15%菊糖培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法:取1 mL種子液接入15%菊糖培養(yǎng)基中,30 ℃、100 r/min 搖床培養(yǎng)。并在發(fā)酵過程中分別于0、4、8、12、24、36、48、60、72、84 h取樣。

1.2.6 蔗糖轉化酶Suc2酶活力測定方法 研究表明,蔗糖酶Suc2同時具有菊糖外切酶活力[9]。因此,基于已報道方法[10],為了更加全面的考察Suc2的水解活性,本研究同時檢測Suc2對蔗糖和菊糖兩種底物的活性。重組菌在15%菊糖培養(yǎng)基發(fā)酵48 h時取樣測定Suc2的蔗糖酶活和菊糖酶活[8]。酶活測定方法:使用0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8)將發(fā)酵菌液稀釋適當倍數(shù),取50 μL稀釋菌液與450 μL蔗糖或菊糖底物(20 g/L,pH 5.0)混勻,50 ℃反應15 min。采用DNS法[22]測定酶活,重組菌的酶活用還原糖含量表示。蔗糖酶及菊糖酶酶活定義:50 ℃條件下,每分鐘水解2%蔗糖或2%菊糖釋放1 μmol葡萄糖當量所需要的酶含量為1 U。

1.2.7 分泌效率測定方法 發(fā)酵液上清蔗糖酶活測定:重組菌在15%菊糖培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后,取發(fā)酵液6 000 g離心3 min,取發(fā)酵液上清液,使用0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8)稀釋適當倍數(shù)后,按照1.2.6方法測定蔗糖酶活。破碎細胞后上清蔗糖酶活測定:重組菌在15%菊糖培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后,取發(fā)酵液6 000 g離心3 min,棄發(fā)酵液上清后加入等體積TES緩沖液(pH 8.0),重懸菌體后加入適量0.4～0.6 mm酸洗玻璃珠,利用組織破碎儀進行反復破碎,直至80%以上釀酒酵母被破碎。隨后將破碎液6 000 g離心3 min,取破碎液上清,使用0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8)稀釋適當倍數(shù)后,按照1.2.6方法測定蔗糖酶活。Suc2的分泌效率由重組菌發(fā)酵液上清蔗糖酶活占重組菌總蔗糖酶活的比率來表征,其中總蔗糖酶酶活為發(fā)酵液上清蔗糖酶活和破碎細胞后上清蔗糖酶活的總和。分泌效率計算具體見公式:

式中:A1為發(fā)酵液上清蔗糖酶酶活;A2為破碎細胞后上清蔗糖酶酶活。

1.2.8 重組菌Western Blot分析 接種重組菌至15%菊糖培養(yǎng)基48 h后,收獲發(fā)酵液濃縮,進行SDS-PAGE凝膠電泳,電轉移至PVDF膜,封閉液室溫封閉2 h,一抗為稀釋后的Suc2特異性抗體,4 ℃過夜孵育,室溫下TBST洗3次,每次10 min。二抗為用TBST稀釋的羊抗兔IgG HRP,4 ℃孵育2 h,室溫下TBS洗3次,每次10 min,DAB顯色,顯色后用圖像處理軟件ImageJ對Western blot結果進行灰度分析。

1.2.9 發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力的測定 取發(fā)酵液上清過0.22 μm濾膜,所得濾液進行氣相色譜檢測。氣相色譜操作條件[23]:色譜柱為安捷倫VF-WAX(30 m×0.25 mm×0.50 μm),頂空方法進行進樣,加熱箱溫度為85 ℃,定量環(huán)溫度為105 ℃,傳輸線溫度為110 ℃,樣品瓶平衡時間為30 min,進樣持續(xù)時間為1 min,GC循環(huán)17 min。進樣量1 μL,檢測器溫度260 ℃。程序升溫條件:75 ℃,保持5 min,以25 ℃/min升至220 ℃,保持10 min。

1.2.10 發(fā)酵液殘?zhí)强偭繙y定方法 取50 μL離心所得上清,加入50 μL 0.5 mol/L H2SO4溶液和400 μL ddH2O,沸水浴30 min后,加入500 μL 0.1 mol/L NaOH溶液,混勻。采用DNS法[22],測定還原糖濃度。

1.2.11 生物量的測定 采用比濁法[24]測定生物量,取50 μL重懸發(fā)酵液加入950 μL ddH2O,測定在600 nm波長下的吸光值(OD600)。

2 結果與分析

2.1 不同分泌信號肽切割位點及疏水性分析

首先,從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和SGD(https://www.yeastgenome.org/)數(shù)據(jù)庫中獲得11種不同蛋白的氨基酸序列。如表2所示,使用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測以上蛋白氨基酸序列中分泌信號肽序列。

表2 本實驗涉及分泌信號肽序列及生物信息學分析Table 2 Sequences and bioinformatics analysis of SP in this study

有實驗證明,分泌信號肽的疏水核心長度及疏水性也影響蛋白質(zhì)的分泌表達,強疏水性的分泌信號肽能夠高效引導新生肽的轉運[12]。有研究表明,對抗體蛋白阿瓦斯汀(Avastin)的分泌信號肽疏水區(qū)進行改造后,用新的疏水性較低的分泌信號肽代替原有的分泌信號肽,造成了產(chǎn)量降低[25]。此外,Gierasch等[26]發(fā)現(xiàn)酵母PHOA分泌信號肽疏水核心Leu與Ala的比值為6∶4時,前體蛋白分泌加工能力最高,在此比值附近,信號肽分泌加工能力隨疏水性的增強而提高。因此使用Ex PAsy(https://web.expasy.org/protscale/)預測了蛋白的親疏水性,如表2所示,11種不同的分泌信號肽的疏水值在0.803～1.210之間,均較高。其中,疏水值最高的為畢赤酵母黏性蛋白MSB2的分泌信號肽,最低的為釀酒酵母內(nèi)源可溶性細胞壁蛋白SCW11的分泌信號肽。因此,本研究選擇的11種分泌信號肽可以進行后續(xù)實驗。

2.2 內(nèi)源分泌信號肽對Suc2分泌能力的影響

為了確定蔗糖轉化酶Suc2最適分泌信號肽,首先利用RF克隆策略,將5種釀酒酵母內(nèi)源分泌信號肽spAGA2、spEXG1、spPLB1、spPHO5及spSCW11與蔗糖轉化酶Suc2融合并轉化至S.cerevisiaeBY4741中。得到5種重組菌BY-AG、BY-EX、BY-PL、BY-PH及BY-SC。由于蛋白前體跨膜轉運效率與分泌信號肽及成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列相關,對于特定的蛋白質(zhì),疏水性較高的分泌信號肽通常會產(chǎn)生較高的易位效率[27]。由于spAGA2的疏水性較高,可以合理的預測,對于蔗糖轉化酶Suc2,spAGA2可以提供較高的跨膜效率。

首先,利用Western blot檢測了5種重組菌發(fā)酵48 h后細胞內(nèi)Suc2的表達水平(圖1A),灰度分析結果如圖1B所示,5種重組菌細胞內(nèi)Suc2的表達水平與野生型BY-S相似(P>0.05)。以上結果說明,不同分泌信號肽對Suc2細胞內(nèi)的表達水平幾乎沒有影響。為了進一步確定不同信號肽對Suc2的分泌能力的影響,利用Western blot檢測了5種重組菌發(fā)酵48 h后發(fā)酵液上清中Suc2的表達水平,如圖1C所示,在140 kDa處可見明顯Suc2條帶。灰度分析結果如圖1D所示,其中BY-AG中的Suc2表達水平明顯最高,與預測結果一致,說明spAGA2可以使Suc2更有效地分泌到細胞外。而BY-EX中的Suc2表達水平與野生型BY-S相似,BY-PL、BY-PH及BY-SC中的Suc2表達水平相較于野生型BY-S有所降低。

圖1 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后Suc2表達水平分析Fig.1 Expression levels of Suc2 in recombinants after 48 h inulin fermentation A:胞內(nèi)中Suc2的蛋白質(zhì)印跡;B:胞內(nèi)Suc2表達水平定量分析;C:發(fā)酵液上清中Suc2的蛋白質(zhì)印跡;D:發(fā)酵液上清中Suc2表達水平定量分析;以BY-S中Suc2的表達量進行歸一化處理,設置為1.0A: Western blot analysis of intracellular Suc2; B: Quantitative analysis of intracellular Suc2 expression levels; C: Western blot analysis of extracellular Suc2; D: Quantitative analysis of extracellular Suc2 expression levels;The expression level of Suc2 in BY-S was normalized as 1.0

為觀察不同分泌信號肽對Suc2分泌能力的影響,測定5種重組菌酶活。在48 h菊糖發(fā)酵條件下,BY-AG、BY-EX、BY-PL、BY-PH及BY-SC的蔗糖酶酶活如圖2A所示,其中蔗糖酶酶活最高的為BY-AG,相對于未改造分泌信號肽野生型BY-S提高42%。而BY-EX的蔗糖酶酶活相對于野生型則降低了27%,BY-PL、BY-PH和BY-SC的蔗糖酶酶活與野生型的相似。由于Suc2是釀酒酵母水解菊糖產(chǎn)乙醇的關鍵酶,對該酶以菊糖為底物的酶活進行了測定。在48 h菊糖發(fā)酵的條件下,BY-AG、BY-EX、BY-PL、BY-PH和BY-SC的菊糖酶酶活如圖2B所示,其中最高的BY-AG相較于野生型的BY-S提高了26%,而BY-EX、BY-PL、BY-PH和BY-SC均與野生型BY-S相似。

圖2 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后的蔗糖酶酶活(A)及菊糖酶酶活(B)Fig.2 Invertase activity(A) and inulin activity(B) of recombinants after 48 h inulin fermentation“**”代表實驗菌株與對照存在極顯著性差異(P<0.01),圖3、4同″**″ There is a very significant difference between the strain and control (P<0.01),Figure 3 and Figure 4 are the same

為了進一步驗證上述結果,對BY-AG、BY-EX、BY-PL、BY-PH及BY-SC的分泌效率進行了測定。如圖3所示,BY-AG、BY-EX、BY-PL、BY-PH、BY-SC中Suc2的分泌效率在(23.85±1.03)%～(28.71±1.08)%之間。其中,分泌效率最高的為BY-AG相較于野生型BY-S提高了17%。而BY-EX、BY-PL、BY-PH及BY-SC則表現(xiàn)出與野生型BY-S相似的情況(P>0.05),并且與菊糖酶酶活結果保持一致。本研究結果與Mori等[17]學者的研究一致。該團隊使用spAGA2融合β-半乳糖苷酶LacA的菌株上清液表現(xiàn)出的LacA活性是野生型的1.5倍,而融合spEXG1的菌株上清活性是野生型的0.9倍。以上結果說明,使用spAGA2替換Suc2原始分泌信號肽可以有效提高Suc2在釀酒酵母BY4741中的分泌水平。

圖3 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后Suc2的分泌效率Fig.3 The secretory efficiency of Suc2 in recombinants after 48 h inulin fermentation

為了研究5種重組菌利用菊糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力,利用氣相色譜對重組菌發(fā)酵液中的乙醇含量進行了測定。5種重組菌的乙醇產(chǎn)量如圖4所示,其中BY-AG的乙醇產(chǎn)量最高,可達到(78.11±4.44) g/L,相較于野生型BY-S發(fā)酵液中的乙醇含量提高了28%,并且與蔗糖酶酶活及菊糖酶酶活結果一致。而BY-EX、BY-PL、BY-PH及BY-SC與野生型BY-S的乙醇產(chǎn)量相似(P>0.05),同樣與菊糖酶酶活結果保持一致。因此,使用spAGA2融合Suc2的重組菌BY-AG的Suc2分泌表達水平顯著提高,同時BY-AG也是一株能夠利用菊糖高效產(chǎn)乙醇的重組菌。

圖4 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后的乙醇產(chǎn)量分析Fig.4 Ethanol production of recombinants after 48 h inulin fermentation

2.3 異源及優(yōu)化的分泌信號肽對Suc2分泌能力的影響

為了探究釀酒酵母異源分泌信號肽及優(yōu)化的分泌信號肽對蔗糖轉化酶Suc2分泌能力的影響,利用RF克隆策略,將3種釀酒酵母異源的分泌信號肽spPRO、spDAN4、spMSB2及3種優(yōu)化后的分泌信號肽spMFαnat、spMFαopt、spHECH融合轉化至S.cerevisiaeBY4741中。得到6種重組菌BY-PR、BY-DA、BY-MS、BY-NA、BY-OP及BY-HE。如表3所示,其中spMSB2的疏水性最高為1.210,根據(jù)替換內(nèi)源分泌信號肽后的結果,可以預測,對于蔗糖轉化酶Suc2而言,spMSB2將提供更高的跨膜效率,從而使Suc2的表達量提高。

首先,本研究利用Western blot檢測了6種重組菌發(fā)酵48 h后細胞內(nèi)Suc2的表達水平(圖5A),灰度分析結果如圖6B所示,6種重組菌細胞內(nèi)Suc2的表達水平與野生型BY-S相似(P>0.05)。以上結果與內(nèi)源信號肽重組菌結果一致,進一步驗證,不同分泌信號肽對Suc2細胞內(nèi)的表達水平幾乎沒有影響。為了進一步確定不同信號肽對Suc2的分泌能力的影響,利用Western blot檢測了6種重組菌發(fā)酵48 h后發(fā)酵液上清中Suc2的表達水平,如圖5C所示,在140 kDa處可見明顯Suc2條帶。灰度分析結果如圖5D所示,BY-PR、BY-DA、BY-MS及BY-HE中的Suc2表達水平有明顯提高,其中BY-MS的表達量最高,與預測結果一致。而BY-NA中的Suc2表達水平與野生型BY-S相似,BY-OP中的Suc2表達水平相較于野生型BY-S有所降低。

圖5 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后Suc2表達水平分析Fig.5 Expression levels of Suc2 in recombinants after 48 h inulin fermentationA:胞內(nèi)Suc2的蛋白質(zhì)印跡;B:胞內(nèi)Suc2表達水平定量分析;C:發(fā)酵液上清中Suc2的蛋白質(zhì)印跡;D:發(fā)酵液上清中Suc2表達水平定量分析;以BY-S中Suc2的表達量進行歸一化處理,設置為1.0A: Western blot analysis of intracellular Suc2; B: Quantitative analysis of intracellular Suc2 expression levels; C: Western blot analysis of extracellular Suc2; D: Quantitative analysis of extracellular Suc2 expression levels;The expression level of Suc2 in BY-S was normalized as 1.0

圖6 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后的蔗糖酶酶活(A)及菊糖酶酶活(B)Fig.6 Invertase activity(A) and inulin activity(B) of recombinants after 48 h inulin fermentation* 代表實驗菌株與對照存在顯著性差異(P<0.05),** 代表實驗菌株與對照存在極顯著性差異(P<0.01),圖7、8同* There is a significant difference between the strain and control (P<0.05),** There is a very significant difference between the strain and control (P<0.01),figure 7 and figure 8 are the same

為了比較不同異源及優(yōu)化分泌信號肽和內(nèi)源分泌信號肽spAGA2對Suc2分泌能力的影響,在48 h菊糖發(fā)酵的條件下,BY-PR、BY-DA、BY-MS、BY-NA、BY-OP、BY-HE及BY-AG的蔗糖酶酶活如圖6A所示,BY-DA、BY-MS及BY-HE相較于未改造分泌信號肽的野生型BY-S的蔗糖酶酶活有顯著提高,其中最高的BY-MS較野生型提高了80%,同時BY-MS較改造內(nèi)源分泌信號肽的BY-AG提高了24%。BY-PR與BY-NA的蔗糖酶酶活與野生型相似(P>0.05),而BY-OP的蔗糖酶酶活則較野生型降低了50%。在48 h菊糖發(fā)酵的條件下,BY-PR、BY-DA、BY-MS、BY-NA、BY-OP、BY-HE及BY-AG的菊糖酶酶活如圖6B所示,BY-MS及BY-HE相對于野生型BY-S的菊糖酶酶活有顯著提高,其中最高的BY-MS較野生型提高了74%,較BY-AG提高了35%。BY-PR、BY-DA、BY-NA及BY-HE的菊糖酶酶活與野生型相似(P>0.05),而BY-OP則較野生型降低了53%。結果表明,異源分泌信號肽具有提高Suc2的表達水平的潛力,而序列優(yōu)化改造的信號肽spMFαopt卻使Suc2的表達水平顯著降低,說明spMFαopt不適用于蔗糖轉化酶Suc2。

為驗證上述結果,對BY-PR、BY-DA、BY-MS、BY-NA、BY-OP、BY-HE及BY-AG的分泌效率進行了測定。如圖7所示,分泌效率最高的BY-MS較野生型BY-S提高了20%,BY-OP分泌效率最低,相較于野生型降低了33%,且與蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活結果一致。而BY-PR、BY-DA、BY-NA及BY-HE的分泌效率與野生型相似(P<0.05)。本研究結果與Duan等[20]的研究一致。該團隊使用spMSB2融合yEGFP、Gal、SECA后使其細胞外產(chǎn)量提高了1.5～8.0倍。

圖7 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后Suc2的分泌效率Fig.7 The secretory efficiency of Suc2 in recombinants after 48 h inulin fermentation

為了研究重組菌利用菊糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力,利用氣相色譜對重組菌發(fā)酵液中的乙醇含量進行了測定。重組菌的乙醇產(chǎn)量如圖8所示,其中BY-MS的乙醇產(chǎn)量最高,可達到(86.31±2.59) g/L,相較于野生型BY-S發(fā)酵液中的乙醇含量提高了56%,相較于BY-AG提高了7%,并且與蔗糖酶酶活及菊糖酶酶活結果一致。而BY-PR、BY-DA、BY-NA、BY-OP及BY-HE與野生型BY-S的乙醇產(chǎn)量相似(P>0.05)。因此,使用spMSB2融合Suc2的重組菌BY-MS的Suc2分泌表達水平顯著提高,同時BY-MS也是一株能夠利用菊糖高效產(chǎn)乙醇的重組菌。

圖8 重組菌株菊糖發(fā)酵48 h后的乙醇產(chǎn)量分析Fig.8 Ethanol production of recombinants recombinants after 48 h inulin fermentation

2.4 BY-MS搖瓶發(fā)酵性能分析

為了對先前實驗中發(fā)酵性能最優(yōu)異的重組菌BY-MS進行進一步表征,將BY-S與BY-MS分別以1%的接種量接種到菊糖培養(yǎng)基進行厭氧發(fā)酵,在對數(shù)生長前期每4 h取一次樣,此后每12 h取一次樣,對樣品生物量、蔗糖酶酶活、殘?zhí)强偭考耙掖籍a(chǎn)量進行測定。如圖9所示,隨著菌體不斷生長,BY-S與BY-MS的菊糖消耗量均不斷增加,兩者均在24 h生物量達到峰值,且BY-MS顯著高于BY-S(P<0.05),推測是由于BY-MS的蔗糖轉化酶Suc2表達量提高,更有效的利用菊糖供給重組菌生長。隨后由于發(fā)酵過程中代謝物質(zhì)的產(chǎn)生,如乙醇、乙酸等,以上物質(zhì)不利于菌體生長,此后生物量呈現(xiàn)出逐漸下降趨勢。與此同時,BY-S與BY-MS的蔗糖酶酶活隨著時間推移逐漸升高,可能是由于Suc2在發(fā)酵過程中逐漸積累的原因,在48 h時,BY-MS的蔗糖酶酶活達到(126.61±7.20) U/mL顯著高于BY-S的(81.35±1.06) U/mL(P<0.01)。最后,BY-S與BY-MS的乙醇產(chǎn)量均在48 h達到峰值,其中BY-MS發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量(81.35±1.07) g/L顯著高于BY-S的(56.45±1.06) g/L(P<0.01),且BY-MS乙醇生產(chǎn)強度(1.69 g/(L·h))顯著高于BY-S(1.18 g/(L·h))。Yuan等[28]在釀酒酵母JZIC的染色體上整合了黑曲霉的菊糖內(nèi)切酶基因,并優(yōu)化了其啟動子和信號肽,結果表明,含有啟動子TDH3ph和信號肽MFα的重組菌可以有效水解菊糖,其利用比本工作初始濃度更高的200 g/L菊糖發(fā)酵48 h的乙醇產(chǎn)量達到55.3 g/L。與之相比,BY-MS利用更低濃度的菊糖(150 g/L)在相同的發(fā)酵時間內(nèi),生產(chǎn)了更高濃度的乙醇(81.35 g/L),表現(xiàn)出更好的發(fā)酵性能。以上結果表明,BY-MS中蔗糖轉化酶Suc2的表達水平顯著高于野生型BY-S,同時可以更好的利用菊糖生產(chǎn)乙醇。

圖9 重組菌株BY-S(A)、BY-MS(B)發(fā)酵過程中生物量、蔗糖酶酶活、乙醇產(chǎn)量和殘?zhí)强偭康臏y定Fig.9 Determination of biomass, invertase activity, ethanol production and total residual sugar during fermentation of recombinant strains BY-S (A) and BY-MS (B)

3 討 論

燃料乙醇是一種可再生的清潔生物質(zhì)能源,其工業(yè)化生產(chǎn)對緩解能源壓力、保護及改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義[29-30]。以菊糖為原料,利用釀酒酵母生產(chǎn)生物乙醇具有節(jié)約生產(chǎn)成本、產(chǎn)量高等優(yōu)點[31]。其中,天然釀酒酵母中利用菊粉的關鍵水解酶—蔗糖轉化酶Suc2分泌表達水平較低,直接影響其轉化菊糖產(chǎn)乙醇的效率,無法滿足工業(yè)需求。本研究為提高釀酒酵母中蔗糖轉化酶Suc2的分泌水平,選擇了11種不同的分泌信號肽,包括釀酒酵母內(nèi)源性、其他菌株來源以及已報道序列優(yōu)化改造的信號肽,隨后,使用RF克隆的策略將11種分泌信號肽與蔗糖轉化酶Suc2融合,并構建了相應的表達菌株。對所有重組菌的蛋白分泌水平、酶活及乙醇產(chǎn)量的測定結果表明,不同的分泌信號肽指導Suc2分泌到細胞外的能力各有不同。其中,含有來源于畢赤酵母黏性蛋白信號肽MSB2的重組菌BY-MS的蛋白分泌水平、酶活及乙醇產(chǎn)量,相對于未改造分泌信號肽的原始菌有顯著提高。重組菌BY-MS的蔗糖酶酶活與菊糖酶酶活較野生型BY-S分別提高了80%和74%,蔗糖轉化酶Suc2的分泌效率提高了20%。同時,重組菌BY-MS利用菊糖產(chǎn)乙醇的能力提高了56%,產(chǎn)量達到86.31 g/L。最后對重組菌BY-MS搖瓶發(fā)酵性能分析時發(fā)現(xiàn),發(fā)酵48 h時,BY-MS的乙醇生產(chǎn)強度達到峰值,BY-MS乙醇生產(chǎn)強度(1.69 g/(L·h))較野生型BY-S(1.18 g/(L·h))提高了44%。

目前,越來越多的新策略被用于釀酒酵母的菊糖發(fā)酵過程優(yōu)化、菌種改良及代謝調(diào)控中,以克服菌株自身局限性[4]。Onsoy等[32]比較了酸處理菊糖法和菊糖酶水解菊糖后發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的效果,結果表明,當用硫酸水解菊芋汁后進行乙醇發(fā)酵時,其生產(chǎn)能力為0.65 g/(L·h),而用菊糖酶水解菊芋汁后發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的生產(chǎn)能力為 0.39 g/(L·h)。Yuan等[33]將馬克斯克魯維酵母和假絲酵母外切菊糖酶基因在釀酒酵母中的表達,并比較了兩種重組子利用菊糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的性能,結果表明,來自于假絲酵母的外切菊糖酶基因更適于構建釀酒酵母工程菌,其乙醇生產(chǎn)強度為1.35 g/(L·h)。Hong等[34]在釀酒酵母D452-2中異源表達了馬克斯克魯維酵母外切菊糖酶基因,并優(yōu)化改造了其啟動子和分泌信號肽,結果表明含有啟動子PGK1和分泌信號肽MFα的重組菌利用188.2 g/L菊糖發(fā)酵66 h乙醇產(chǎn)量達到80.2 g/L,乙醇生產(chǎn)強度為1.22 g/(L·h)。與以上研究成果相比,本研究構建的釀酒酵母重組菌BY-MS利用低于文獻報道的菊糖濃度(150 g/L)發(fā)酵時,乙醇生產(chǎn)強度(1.69 g/(L·h))更高,表現(xiàn)出更好的發(fā)酵菊糖產(chǎn)乙醇性能。本研究為提高蔗糖轉化酶Suc2的分泌水平、構建高效菊糖基乙醇生產(chǎn)菌株提供參考。