氧化脅迫誘導蒼白桿菌JP1形成VBNC狀態及其特征

陳飛飛, 陳吉祥*, 王永剛, 徐嘉茜, 陳詩源

(1.蘭州理工大學 石油化工學院,甘肅 蘭州 730050;2.蘭州理工大學 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730050)

石油開發及使用過程中造成的環境污染問題日益嚴重,生物修復技術因對環境友好而成為最具前景的污染治理技術[1]。以石油降解菌為主體的生物修復技術已成為近年研究的熱點[2-3]。目前,已有200多種可降解石油的微生物被發現,其中細菌的石油降解效率較高[4-5]。蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)存在于多種復雜環境中,能有效降解石油烴等污染物[6-7]。在惡劣的自然環境中,大部分微生物能形成活的非可培養(Viable but non-culturable state,VBNC)狀態[8-9]。VBNC狀態是指某些細菌在不良環境中形成的一種休眠狀態,常規培養條件無法繁殖,但可保持代謝活性[9-11]。研究表明低溫、寡營養、抗生素、有毒物質及H2O2等可誘導細菌進入VBNC狀態[12-14]。VBNC狀態的細胞在適宜條件下復蘇為可培養形式[15-17]。氧化應激對大腸埃希菌、芽胞桿菌和沙門氏菌等細菌的作用已被廣泛研究[14,18],如低濃度的H2O2會使沙門氏菌進入VBNC狀態[19]。目前關于微生物VBNC狀態的研究多集中于食品檢測、流行病學及公共衛生學等領域的大腸埃希菌、沙門氏菌等菌株,而對污染物環境生物修復領域的微生物,如蒼白桿菌研究較少[20-24]。本研究通過不同濃度的H2O2處理蒼白桿菌JP1,使其進入VBNC狀態,研究蒼白桿菌JP1細胞VBNC狀態的形成過程,VBNC狀態細胞的形態,復蘇后蒼白桿菌RJP1的生長特性及石油降解能力,有助于進一步探究蒼白桿菌在惡劣條件下的存活機制,為石油污染環境生物修復的菌種篩選及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 實驗所用的蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)JP1分離自西部荒漠地區的石油污染土樣。土樣溶解后采用LB固體培養基進行菌種初步篩選、原油基礎培養基復篩,并將篩得的菌種保藏于蘭州理工大學石油化工學院環境生物技術實驗室。

1.1.2 培養基(g/L) ①LB培養基:蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,瓊脂20,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0;②基礎培養基:NH4NO33,K2HPO41.5,KH2PO41.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.1,CaCl20.01,FeCl20.01,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 LIVE/DEADBacLight細菌活力檢測試劑盒(生工(上海)股份有限公司),其他試劑均為國產和進口分析純。紫外分光光度計(UV-2102PC,尤尼柯上海儀器公司);紅外測油儀(OIL-460,北京華夏科創公司);激光共聚焦顯微鏡(FV-2000,奧林巴斯);掃描電子顯微鏡(JSM-5600LV,日本電子光學公司);透射電子顯微鏡(HT7800,HITACHI);臺式高速冷凍離心機(Neofuge 15R,上海力申科學儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度H2O2對蒼白桿菌JP1生長的影響 挑取蒼白桿菌JP1單菌落接種于裝有50.0 mL LB培養基的三角瓶,180 r/min、30 ℃恒溫培養至對數期。以1.0%(體積分數,下同)的接種量接種于裝有50.0 mL LB培養基的三角瓶,培養至培養液OD600為0.211～0.273,分別添加30.0%的H2O2,使得培養液H2O2的終濃度為0.0、10.0、25.0、50.0和75.0 mmol/L,180 r/min、30 ℃恒溫搖床培養;0、6、12、24、36、48 h取樣,紫外分光光度計測定OD600,篩選出有效抑制蒼白桿菌JP1生長的H2O2濃度。

1.2.2 H2O2誘導蒼白桿菌JP1形成VBNC狀態 將培養液取出測定OD600為0.211～0.273,添加30.0% H2O2,以有效抑制蒼白桿菌JP1生長的H2O2初濃度為實驗組,對照組添加同體積無菌水,每組3個平行。分別于0、6、12、24、36、48 h取樣,紫外分光光度法測定OD600,平板涂布法對可培養細胞數進行計數,LIVE/DEADBacLight細菌活力檢測試劑盒染色,激光共聚焦顯微鏡觀察,通過軟件Image J進行總細胞數、活細胞數計數[16]。

1.2.3 細胞形態觀察 掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察細胞形態,樣品在8 500 r/min、4 ℃下離心10 min后收集細菌沉淀。0.85%無菌生理鹽水重懸后離心,重復3次,棄去上清,2.5%的戊二醛固定沉淀。根據Ding等[25]的方法進行掃描和透射電子顯微鏡分析。

1.2.4 VBNC狀態蒼白桿菌細胞的復蘇 蒼白桿菌JP1經H2O2誘導進入VBNC狀態后,取5.0 mL菌液10 000 r/min、4 ℃離心5 min,棄去上清,5.0 mL 0.85%生理鹽水重懸菌體沉淀。1.0%的接種量接種于裝有50.0 mL LB培養基的三角瓶,實驗組添加經濾膜除菌的丙酮酸鈉溶液,使丙酮酸鈉的濃度為50.0 mmol/L,對照組添加同體積無菌水。180 r/min、30 ℃搖床培養,每組3個平行。0、6、12、24、36 h取樣,紫外分光光度法測定OD600,平板涂布法計數培養液可培養細胞數。

1.2.5 H2O2處理前后蒼白桿菌JP1生長特性分析 將蒼白桿菌JP1和復蘇后的蒼白桿菌RJP1以1%的接種量接入裝有50.0 mL LB培養基的三角瓶中,分別于10、20、25、30、35、40和50 ℃,180 r/min培養24 h,測定OD600,確定溫度對菌株JP1和菌株RJP1生長的影響;菌株以1%的接種量接入pH分別為4、5、6、7、8、9和10的LB培養基中,180 r/min、30 ℃培養24 h,測定OD600確定pH對細菌生長的影響;以1%的接種量接入NaCl濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的LB培養基中,180 r/min、30 ℃培養24 h,測定OD600值,觀察NaCl對菌株生長的影響。

1.2.6 石油降解率測定 將蒼白桿菌JP1和復蘇后的蒼白桿菌RJP1以2.0%的接種量接種于含有一定濃度石油的基礎培養基中,180 r/min、30 ℃恒溫培養7 d。培養液取出后用50.0 mL的四氯乙烯分3次萃取,合并萃取液經Na2SO4(105 ℃烘干48 h)吸收多余水分,轉移至容量瓶定容到50.0 mL,紅外測油儀測定培養液中的石油濃度,根據公式計算菌株的石油降解率[26]。

式中:ω:石油降解率(%);m1:培養液的初始石油濃度 (mg/L);m2:培養液的剩余石油濃度 (mg/L)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度H2O2對蒼白桿菌JP1生長的影響

培養液H2O2終濃度分別為0.0、10.0、25.0、50.0和75.0 mmol/L,培養、取樣測定OD600,繪制蒼白桿菌JP1在不同H2O2濃度下的生長曲線(圖1a)。相比對照組(0.0 mmol/L H2O2),10.0、25.0、50.0和75.0 mmol/L濃度的H2O2均對蒼白桿菌JP1的生長有抑制作用。當培養液的OD600為0.222,H2O2濃度為75.0 mmol/L時,明顯抑制蒼白桿菌JP1的生長。

圖1 H2O2誘導蒼白桿菌JP1進入VBNC狀態Fig.1 Formation of VBNC state of Ochrobactrum sp. JP1 induced by H2O2A:蒼白桿菌JP1在不同H2O2濃度下的生長曲線;b:培養液的OD600; c:培養液的可培養數A: Growth curves of Ochrobactrum sp. JP1 under different concentrations of H2O2; b: OD600 of culture; c: Log10cfu/mL of culture

2.2 H2O2誘導蒼白桿菌JP1形成VBNC狀態

添加H2O2使培養液終濃度為75.0 mmol/L,培養并取樣測定OD600、可培養細胞數、總細胞數和活細胞數。對照組(0.0 mmol/L H2O2)培養液的OD600呈現自然生長,實驗組(75.0 mmol/L H2O2)培養液的OD600基本維持不變(圖1b);培養至6 h時,相對于對照組,實驗組可培養細胞數明顯下降,12 h時實驗組培養液所涂布的LB固體培養基經恒溫培養后表面不再有菌落生長,表明蒼白桿菌JP1在終濃度為75.0 mmol/L的H2O2下培養12 h會進入VBNC狀態(圖1c)。

LIVE/DEADBacLight細菌活力檢測試劑盒染色后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察,活細胞細胞膜完整,染色后為綠色(圖2a),細胞膜受損的死細胞染色后為紅色;總細胞數、活細胞數基本保持不變,可培養數在培養12 h時降為0 cfu/mL(圖2b)。

圖2 細胞染色及總細胞數、活細胞數和可培養細胞計數Fig.2 Cell staining and total cell count, viable cell count and cultivable cell countA:實驗組蒼白桿菌JP1活細胞染色圖;b:總細胞、活細胞和可培養細胞計數A: Staining picture of live cells of Ochrobactrum sp. JP1 in the experimental group; b: Total cell, live cell and culturable cell counts

2.3 細胞形態觀察

掃描電子顯微鏡觀察到未經75.0 mmol/L H2O2處理的蒼白桿菌JP1細胞表面光滑飽滿,呈桿狀(圖3a),經75.0 mmol/L H2O2處理的細胞大部分縮小變成球體(圖3b)。透射電子顯微鏡觀察到未經75.0 mmol/L H2O2處理的蒼白桿菌JP1細胞質分布均勻,細胞壁結構完整(圖3c),而經過75.0 mmol/L H2O2處理的大部分細胞發生明顯變化,主要表現在周質間隙增大、胞內物質聚集、外漏甚至變成“空殼”,但仍有極少數細胞質均勻分布(圖3d)。

圖3 蒼白桿菌JP1細胞H2O2處理前后的細胞形態Fig.3 Cell morphology of Ochrobactrum sp. JP1 cells before and after H2O2 treatmentA:未處理的細胞-SEM;b:75.0 mmol/L H2O2處理的細胞-SEM;c:未處理的細胞-TEM;d:75.0 mmol/L H2O2處理的細胞-TEMA:Untreated cells -SEM;b:H2O2 (75.0 mmol/L) treated cells -SEM;c:Untreated cells -TEM;d:H2O2 (75.0 mmol/L) treated cells-TEM

2.4 VBNC狀態蒼白桿菌JP1的復蘇

通過離心去除原培養液中的H2O2,將VBNC狀態的蒼白桿菌JP1細胞接種于LB培養液恒溫培養。取樣測定如圖4a所示,0～12 h,培養液的OD600基本維持不變;12 h以后,培養液的OD600明顯增加。培養液中可培養細胞數變化見圖4b,培養至6 h,對照組(0.0 mmol/L丙酮酸鈉)和實驗組(50.0 mmol/L丙酮酸鈉)LB培養液中蒼白桿菌RJP1的可培養細胞數分別為4 790 cfu/mL和4 820 cfu/mL,隨著培養時間的增加,可培養細胞數持續增加。培養至12 h,實驗組培養液中的可培養細胞數是對照組的1.6倍,24 h時,實驗組培養液中的可培養細胞數是對照組的3.2倍,表明在適宜的生長條件下,移除H2O2脅迫作用后,VBNC狀態的蒼白桿菌JP1能在較短時間內復蘇,恢復可培養性,并且丙酮酸鈉對VBNC狀態蒼白桿菌JP1的復蘇具有促進作用。

圖4 VBNC狀態蒼白桿菌JP1的復蘇Fig.4 The resuscitation of VBNC state Ochrobactrum sp. JP1 A:培養液的OD600;b:培養液的可培養細菌數A:OD600 of the culture; b: The culture numbers

2.5 H2O2處理前后蒼白桿菌JP1的生長特性

將蒼白桿菌JP1和去除H2O2復蘇后的蒼白桿菌RJP1接種于LB培養基,分別于不同溫度、初始pH和鹽度,180 r/min培養24 h,取樣測定數據如圖5所示,2種菌株細胞的適宜生長條件基本一致,溫度25.0～40.0 ℃、pH 5～9、鹽度為0.0%～1.0%,表明VBNC狀態的蒼白桿菌JP1去除H2O2的脅迫作用恢復可培養性后,與自然狀態的蒼白桿菌JP1一樣,具有較好的環境適應能力。

圖5 菌株JP1和菌株RJP1的生長特性Fig.5 Growth characteristics of strain JP1 and strain RJP1A:溫度對菌株生長的影響;b:初始pH對菌株生長的影響;c:鹽度對菌株生長的影響 a: Effect of temperature on the growth of the bacteria; b: Effect of initial pH on the growth of the bacteria; c: Effect of NaCl concentration on the growth of the bacteria

2.6 H2O2對蒼白桿菌石油降解性能的影響

將蒼白桿菌JP1、去除H2O2的脅迫復蘇后的蒼白桿菌RJP1接種于含有一定濃度石油的基礎培養基中,通過紅外測油儀測定培養液中剩余的石油濃度。結果顯示,復蘇后的蒼白桿菌RJP1細胞的石油降解率沒有受到明顯的影響。培養液中石油的初始濃度和剩余濃度,菌株JP1和菌株RJP1的石油降解率如表1所示。

表1 細菌石油降解率測定Table 1 Determination of petroleum degradation rates of the different bacterial cells

3 討 論

H2O2因其具有氧化性而被廣泛應用于微生物的殺菌消毒,并且可誘導細菌進入VBNC狀態。Morishige等[27]的研究結果表明向含腸炎沙門氏菌(Salmonella)細胞濃度為1.0×107cfu/mL的LB培養液中添加H2O2,當培養液的H2O2濃度為10.0 mmol/L,培養45 min后培養液中的腸炎沙門氏菌進入VBNC狀態。本研究發現在初始濃度為8.1×107cfu/mL蒼白桿菌JP1的LB培養液中,當H2O2終濃度為75.0 mmol/L時,30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養12 h后蒼白桿菌JP1 細胞進入VBNC狀態。不同種屬的細菌對H2O2的耐受性存在顯著差異,但培養液初始的細胞濃度是導致其存在顯著差異的主要原因和細菌能否進入VBNC狀態的重要前提。此外,致使細菌進入VBNC狀態的方式是多種多樣的,Ye等[28]的研究結果表明,當培養液中大腸埃希菌(Escherichiacoli)細胞數目為105～6cfu/mL時,0.5 mg/L的余氯處理6 h后大腸埃希菌進入VBNC狀態。

環境因素誘發細菌進入VBNC狀態后,典型的特征是細胞出現收縮變小等形態變化,在大多數細菌細胞中都能觀察到細胞內物質的積累。H2O2誘導蒼白桿菌JP1進入VBNC狀態后,細胞由桿狀變為球狀。透射電子顯微鏡觀察到,VBNC狀態的細胞周質間隙顯著增大,核區被壓縮至細胞中心。在一些經低溫和寡營養誘導而形成的VBNC狀態細菌細胞中也觀察到了同樣的現象。Gao等[29]研究發現鰻弧菌(Vibroanguillarum)細胞經過6個月的饑餓培養,細胞由短棒狀變為球狀,細胞平均長度明顯縮短。聶新穎等[30]采用H2O2處理鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)使其處于VBNC狀態,觀察到細胞形態以及胞內物質的變化情況與本研究觀測結果一致。

VBNC狀態的細菌可以通過不同的條件復蘇。Morishige等[27]通過添加30.0 mmol/L的丙酮酸鈉,對VBNC狀態的腸炎沙門氏菌進行復蘇,結果表明,與對照組(0 mmol/L丙酮酸鈉)相比,腸炎沙門氏菌細胞的可培養性提高90.3倍。本研究發現,在VBNC狀態蒼白桿菌JP1的復蘇過程中,培養至24 h,實驗組(50.0 mmol/L丙酮酸鈉)復蘇培養液中的可培養數是對照組 (0 mmol/L丙酮酸鈉)的3.2倍,說明合適濃度的丙酮酸鈉能夠促進VBNC狀態細菌細胞的復蘇。此外,Pinto等[31]采用改變培養溫度的方法,使低溫(4 ℃)誘導進入VBNC狀態的大腸埃希菌恢復了可培養性。寡營養的土壤培養基經過12 h的培養后,其中耐金屬貪銅菌(Cupriavidusmetallidurans)的可培養數目降為0 cfu/mL,Giagnon等[32]在土壤培養基中添加葡萄糖酸鹽后,培養基中的可培養數恢復到了較高水平。除物理刺激、添加化學物質等復蘇方法外,有些活性蛋白質也有助于VBNC狀態細菌的復蘇,Panutdaporn等[13]通過添加復蘇促進因子(Rpf)使得VBNC狀態的沙門氏菌獲得可培養性。Li等[33]向含VBNC狀態哈維弧菌(Vibroharveyi)的培養液中添加活性蛋白YeaZ,也實現了復蘇。