幼齡小鼠細菌性腦膜炎模型的建立#

馮梓琦 鄭景文 王霞 萬莉紅△

（1. 明遠學園——基礎醫(yī)學拔尖學生培養(yǎng)基地（懷德班）2019 級，四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川 成都 610041；2. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理學教研室，四川 成都 610041；3. 四川大學華西第二醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610041）

細菌性腦膜炎（Bacterial meningitis，BM）是指因病原菌感染導致宿主硬腦膜、蛛網膜、軟腦膜發(fā)生炎癥的感染性疾病，是兒童中樞系統中最常見的感染性疾病。臨床常見表現為發(fā)熱、頸強直、癲癇發(fā)作、譫妄、嗜睡、昏迷等[1]。肺炎鏈球菌是最常見的致病菌之一[1-4]，在現有的預防治療措施下，仍具有高致死致殘率[2,3][5]。據研究，細菌性腦膜炎致死率在兒童感染性疾病中排行前十[2]，25-50%的幸存患者會出現嚴重的認識障礙、繼發(fā)性腦水腫、神經組織形成壞死性病灶等神經系統后遺癥[4]。細菌性腦膜炎的具體發(fā)病機制尚不清楚。目前認為病原菌可以直接侵犯或間接通過引起各類炎性因子的釋放來破壞血腦屏障的完整性或改變其通透性，從而最終入侵中樞神經系統，引起嚴重的神經損害甚至死亡[5]。

現已有多種成年動物模型用于研究細菌性腦膜炎。例如，通過鼻腔滴注或腹腔注射菌懸液建立的血源性感染模型多用于研究致病機理和疫苗開發(fā)，但其造模成功率僅在50%左右[6,7]。為了更高效的建立動物模型，目前的普遍方法是將菌懸液直接注射入腦室系統，注射方式包括側腦室注射（Intracerebroventricular injection，ICV）[8]和小腦延髓池注射[9]等。其中，側腦室注射技術成熟、成功率高，是較為常用的造模方法。既往研究發(fā)現，哺乳期大鼠細菌性腦膜炎模型與成年模型相比具有特殊性，海馬和皮質的損傷表現不同[10,11]。因此，為了更好的探究兒童細菌性腦膜炎的致病機理和診療靶點，建立幼齡小鼠模型十分重要，但目前尚無研究確定幼齡小鼠側腦室注射坐標。本文擬通過側腦室注射伊文思藍確認4 周齡小鼠ICV 坐標，并以此為基礎注射肺炎鏈球菌懸液初步評估腦膜炎模型建立情況，以期為后期研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及菌株

4 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，購自成都達碩實驗動物有限公司（中國，成都），飼養(yǎng)于獨立送風隔離籠具中，光暗循環(huán)12:12，溫度22°C、濕度55%。

肺炎鏈球菌D39 菌株（血清型2 型），由四川大學華西第二醫(yī)院保種。

1.1.2 試劑

THB 培養(yǎng)基（海博生物，中國青島），酵母提取物（北京索萊寶科技有限公司，中國北京），哥倫比亞血平板（環(huán)凱微生物科技有限公司，中國廣東），PBS 緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司，中國武漢）伊文思藍染色液（北京索萊寶科技有限公司，中國北京），戊巴比妥鈉（由機能實驗室提供）。

1.2 方法

1.2.1 肺炎鏈球菌培養(yǎng)及懸液制備

肺炎鏈球菌D39 菌株培養(yǎng)于哥倫比亞血平板上，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中。挑取菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中（含0.5%酵母提取物），置于恒溫搖床中過夜(搖床溫度37°C，振速260 r·min-1）。將1 體積的過夜培養(yǎng)基（5 mL）加入20 體積的新鮮肉湯中，并孵育至生長對數期，收菌。收菌后9000 rpm 低溫離心4 min，PBS 重懸稀釋，均勻涂開分布于血瓊脂平板上，放入培養(yǎng)箱過夜。

制作菌懸液時用生理鹽水潤洗平板3 次，9000 rpm 低溫離心4 min，棄去上清，獲得菌體沉淀。生理鹽水重懸，調整菌懸液濃度至1×109CFU·mL-1（OD600=1），后根據注射所需濃度進行稀釋。

1.2.2 4 周齡小鼠右側腦室注射

小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，稱重，腹腔注射給予戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉。后將小鼠固定于立體定位儀（瑞沃德生命科技有限公司，中國廣東）上，備皮，于兩耳平齊位置沿中線剪開頭頂皮膚。根據成年小鼠ICV 坐標（ML：-1.5 mm，AP：-0.6 mm，DV：-1.7 mm）及發(fā)育期小鼠腦成像[12]摸索4 周齡小鼠右側腦室坐標。確定試驗坐標后用顱骨鉆鉆孔，使用玻璃微針注射器（瑞沃德生命科技有限公司，中國廣東）以0.5 μL·min-1的速度緩慢注射2 μL 伊文思藍。留針觀察15 min 后處死小鼠，剪開顱骨觀察染液擴散分布。

1.2.3 4 周齡小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型的構建

確認4 周齡小鼠注射坐標為ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm，采用上述方法向小鼠右側腦室注射2 μL 含3.5×105CFU 肺炎鏈球菌懸液，留針15 min 后縫合，術后復溫。對照組注射等量生理鹽水。

1.2.4 Loeffler 神經行為學評分

術后20 h 分別對模型組及對照組小鼠進行Loeffler 神經行為學評分：5 分-抓住背部時能正常運動，在5 秒內翻身；4 分-自主運動減少；3分-翻身＞5 s；2 分-不能翻身；1 分-不能運動；0 分-死亡。

1.2.4 病理評價

術后20 h 仍存活的動物，進行Loeffler 神經行為學評分后斷頸處死。立即用無菌手術剪沿后囟剪開顱骨，取出腦組織置于4%多聚甲醛4°C 固定，石蠟包埋后切片，HE 染色。每張切片在100 倍鏡下隨機選取5 個視野觀察軟腦膜、蛛網膜結構形態(tài)及鄰近皮層炎癥細胞浸潤情況。

1.3 統計學分析

所有數據通過GraphPad Prism 8.0 進行分析，計量資料以均數±標準差（±SD）表示，采用one-way ANOVA 方差分析檢驗，其中P＜0.05表示差異具有統計學差異。

2 結果

2.1 ICV 注射坐標

定位小鼠右側腦室（中線右旁開1.3 mm，前囟后0.5 mm，垂直深度1.6 mm，即ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm），以0.5 μL·min-1 的速度緩慢注射2 μL 伊文思藍。如圖1 所示，背面觀注射創(chuàng)傷小，15 min 后染液由右側腦室隨腦脊液循環(huán)分布至雙側側腦室、顱底窩等。

圖1 經側腦室向4 周齡小鼠注射伊文思藍后頭顱解剖示意圖

2.2 4 周齡小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型初步建立成功

以2 μL 生理鹽水或等體積3.5×105CFU 肺炎鏈球菌懸液分別側腦室注射，于20 h 后進行Loeffler 神經行為學評分。對照組小鼠進食飲水正常，活動良好；模型組有一只小鼠死亡，其余小鼠均出現不同程度的活動能力喪失，伴隨呼吸明顯加快和震顫。統計學結果顯示模型組Loeffler 神經行為學評分明顯低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 Loeffler 神經行為學評分評估造模效果（±SD，n=6）

表1 Loeffler 神經行為學評分評估造模效果（±SD，n=6）

注：與對照組相比，**P＜0.01。

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2.3 4 周齡小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎模型的病理改變

鏡下觀察小鼠腦組織切片HE 染色結果，肺炎鏈球菌懸液感染20 h 后，模型組小鼠蛛網膜結構被破壞，軟腦膜充血，出現明顯的炎性細胞浸潤；而對照組小鼠腦膜結構正常，見圖2。

圖2 HE 染色觀察小鼠腦膜結構變化（100×）

3 討論

細菌性腦膜炎是兒童高發(fā)的感染性疾病，現認為病原菌可直接或間接引起中樞損傷，造成嚴重腦功能障礙，甚至導致患兒死亡。過去的研究多使用成年動物疾病模型，但已知幼齡嚙齒類腦膜炎動物模型的腦損傷具有特殊性[10,11]。故為了有針對性的探究兒童細菌性腦膜炎的致病機理，建立更高效穩(wěn)定的幼齡動物模型十分必要。在小鼠中，側腦室注射菌懸液是常用的肺炎鏈球菌腦膜炎模型的建立方法。但因幼齡小鼠仍處發(fā)育期，尚無研究給出詳細的側腦室注射坐標、造模方法及模型評價結果。

本研究使用4 周齡C57BL/6 雄性小鼠，以成年小鼠右側腦室坐標及小鼠發(fā)育階段腦成像為依據，定位注射伊文思藍染液，后處死小鼠并剪去顱骨，從腦整體及矢狀切面可觀察到藍色染液沿腦脊液循環(huán)分布至腦室系統、蛛網膜下腔等處。故確定該年齡段小鼠側腦室注射的可行坐標為ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm。除此之外，本研究使用的玻璃微針注射器造成的創(chuàng)傷較小，有效的提升了注射安全性和小鼠存活率，有助于模型的穩(wěn)定建立。前人研究發(fā)現，血源性感染造模的成功率較低，直接向小鼠的側腦室注射菌懸液可以同時提高造模成功率和模型動物生存率[8]。本文確定了4 周齡小鼠側腦室定位后，進行了肺炎鏈球菌（D39 菌株）懸液ICV 造模。20 h 后觀察，模型組小鼠出現明顯的腦膜炎癥狀，包括呼吸急促、震顫、活動能力顯著減弱甚至死亡。病理切片顯示模型組小鼠出現明顯的腦膜結構破壞及炎癥浸潤，故說明該模型基本建立成功。綜上所述，本文確定了4 周齡C57BL/6 雄性小鼠右側腦室注射坐標，可用于建立穩(wěn)定高效的幼齡小鼠細菌性腦膜炎模型，有助于推進兒童細菌性腦膜炎相關基礎研究。