李娜 沈江立 柳越冬 吳憲樹 王磊 盛天驕 姚紅娟

潰瘍性結腸炎(UC)好發于歐美國家,然而相關統計資料顯示,近年來我國發病人數也在持續增加[1]。 現階段,藥物是治療UC的主要方式,臨床應用最廣泛且效果較好的是氨基水楊酸類、糖皮質激素類等藥物。相關研究結果表明,此類藥物具有非特異性的抗炎效果,近期治療效果尚可,但不良反應較多[1]。優化潰結方是柳越冬教授臨床對 UC 脾虛濕熱證型的臨床驗方,健脾益氣,祛除濕熱標本兼治臨床應用長達 20 余年,臨床療效顯著[2-5]。動物實驗證實,該復方可以改善 UC 模型大鼠的疾病癥狀,調節細胞外信號調節激酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERK)、白細胞介素-1β 等表達水平,改善腸道炎癥[3]。網絡藥理學分析技術揭示優化潰結方可調控腸道免疫應答涉及白介素-17 免疫信號通路、Toll 樣受體信號通路[4]。優化潰結方內含小分子化合物大豆苷元、槲皮素。單體大豆苷元可調節 IL-6 水平,抑制 p65-NF-KB、p-IKB-a、p-IKK,緩解腸道黏膜炎癥,槲皮素能夠改善腸道菌群紊亂,恢復腸道屏障結構與功能[6]。本研究分析氣滯血瘀模型UC大鼠的腸道菌群、結腸炎疾病活動指數(DAI),從腸道菌群角度探討該療法的治病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠,體重200～240 g,由西安交通大學醫學實驗動物中心提供,合格證號2018-001,室溫(20±2)℃,相對濕度50%～60%。實驗動物詞養及觀察在咸陽市中心醫院實驗中心進行,實驗方案經咸陽市中心醫院倫理委員會審批。

1.2 UC(氣滯血瘀型)動物模型建立 制備模型方法參考TNBS/乙醇二次致炎法結合束縛法[2]。模造模方法:SD大鼠適應性飼養1星期,限制大鼠四肢活動度(約8 h/d),后給予TNBS /乙醇溶液灌注結腸,造模前,禁食不禁水24 h,稱重后用3 ml/kg戊巴比妥鈉麻醉,將灌胃針從肛門插至距肛門8 cm處,60 mg/kg TNBS溶液緩慢灌腸,誘導急性結腸炎。15 d后(首次造模第16天)再次采用同樣的方法給予30 mg/kg TNBS溶液灌腸,造成復發性結腸炎。2次灌腸后均注入0.5 ml空氣,倒立數分鐘,取仰臥位放回飼養籠,正常喂養。正常組按上述方法對動物實施0.9%氯化鈉溶液灌腸。

1.3 藥品制備 優化潰結方組成:黃芪20 g、炒白術15 g、蒼術10 g、青黛3 g、敗醬草20 g、白頭翁15 g、紅花10 g,以上藥物均購自于咸陽市中心醫院中藥房,以上復方總用量為93 g,加水浸泡45 min,文火煎煮40 min后濾取藥液,藥渣加同體積水繼續煎煮30 min,2次所得濾液合并并濃縮定容至93 ml。此時優化潰結方藥液濃度為1 g/ml,灌入清潔玻璃容器中,封口高壓滅菌后于4℃溫度條件下冷藏,以便后續研究使用。60 kg人與200 g大鼠折算比為 6.25∶1,換算出大鼠灌胃藥物的對應濃度:以1.674 g·kg-1·d-1灌胃[6],1次/d,共14次。本研究中使用的柳氮磺胺吡啶由上海福達制藥公司生產。用藥前,需要加水浸泡一段時間,本品總用量為6 g,定容至6 ml。此時柳氮磺胺吡啶組藥液濃度為1 g/ml,灌入清潔玻璃容器中,封口高壓滅菌,4℃冷藏備用,以0.54 g·kg-1·d-1灌胃,1次/d,共14次。

1.4 分組處理 將24只SD大鼠,隨機分成正常組、模型組、優化潰結方組、柳氮磺吡啶組,每組4只。其中模型組、優化潰結方組、柳氮磺吡啶組均采用TNBS /乙醇二次致炎法制備UC大鼠模型。①正常組和模型組小鼠給藥方式為灌胃等體積的水。②優化潰結方組應用配制成含生藥濃度為1 g/ml的溶液,以1.674 g·kg-1·d-1灌胃,1次/d,共14次。③柳氮磺胺吡啶組藥液濃度為1 g/ml,以0.54 g·kg-1·d-1灌胃,1次/d,共14次。

1.5 16S rDNA測序和宏基因組檢測 治療前后收集糞便,進行16S rDNA測序,方法簡要如下:離心提取DNA樣本;取1 μl定量檢測DNA樣本質量,合格后,采用16S PCR擴增(引物:341F-CCTAYGGGRBGCASCAG, 806R-GGACTACNNGGGTATCTAAT)后,樣本按照Illumina Miseq高通量測序儀使用指南進行測序,運行3～5 d下機,原始數據轉換成FastQ格式,數據質量達到Q30 80%以上。對于細菌操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)按序列相似性>97%聚類成一個OUT, OTU聚類采用Uparse軟件,得到豐度表。使用RDP 數據庫(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)對腸道細菌進行物種注釋。

1.6 分組大鼠DAI評分比較 DAI是體重、糞便性狀及便血情況相加后得出的均值,即DAI = (體重下降分數+糞便性狀分數+便血分數)/3[1],按相關標準[2]判定造模成功,分組進行大鼠DAI評分比較。

1.7 統計學分析 應用SPSS 28.0統計軟件,計量資料進行組間橫向對比時引入獨立樣本曼-惠特尼U檢驗,多樣性指數采用studentt檢驗;計數資料采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分組大鼠DAI評分比較 與正常組比較,模型組大鼠DAI評分明顯增加(P<0.05);與模型組比較,優化潰結方組、柳氮磺胺吡啶組均有顯著差異(P<0.05)。柳氮磺胺吡啶組與優化潰結方組DAI評分比較,無差異(P>0.05)。見表1。

表1 優化潰結方UC大鼠DAI評分的影響 n=6,

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析 畫出4組腸道菌群與健康組物種相對豐度累積曲線,其橫縱坐標分別代表測序量、Alpha多樣性指數。隨著2組樣本量增加,Alpha曲線波動幅度越來越小,樣本量足以反映豐富度等變化情況。與正常組比較,模型組Shannon指數升高,差異有統計學意義(P<0.01),說明UC氣滯血瘀模型SD大鼠腸道菌群多樣性較高;與模型組比較,優化潰結方組患者 Shannon指數降低(P<0.01),與柳氮磺胺吡啶組比較,優化潰結方組患者 Shannon指數差異無統計學意義(P>0.05),說明優化潰結方能降低UC炎氣滯血瘀模型SD大鼠腸道菌群多樣性。見圖1、2。

圖1 4組樣本物種累積曲線圖;A 正常組VS模型組;B 柳氮磺胺吡啶組(陽性藥組)VS 優化潰結方組;C 模型組VS柳氮磺胺吡啶組(陽性藥組);D 模型組VS優化潰結方組

圖2 4組樣本Shannon指數比較;A 正常組VS模型組(P=0.00069);B 柳氮磺胺吡啶組(陽性藥組)VS優化潰結方組(P=0.68);C 模型組VS柳氮磺胺吡啶組(陽性藥組)(P=1e-05);D 模型組VS 優化潰結方組(P=4.1e-05)

2.3 腸道菌群Beta多樣性分析 模型組與正常組,優化潰結方組與模型組、陽性藥組(柳氮磺胺吡啶組)與模型組腸道微生物組織結構比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4組間Beta多樣性箱型圖;A 正常組VS模型組(P= 8.64E-07 ,Wilcoxon檢驗);B 柳氮磺胺吡啶組(陽性藥組)VS優化潰結方組(P=0.11,Wilcoxon檢驗);C 模型組VS柳氮磺胺吡啶組(陽性藥組)(P= 1.29E-08,Wilcoxon檢驗);D 模型組VS優化潰結方組(P= 1.29E-08,Wilcoxon檢驗)

2.4 優化潰結方治療前﹑后腸道菌群差異比較 給予優化潰結方治療后,厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、雙歧桿菌科、格氏乳桿菌種、鼠乳桿菌種、乳酸菌屬相對豐度出現了顯著增加(P<0.05);擬桿菌門、變形菌門、梭狀芽孢桿菌綱、擬桿菌綱、丹毒絲菌綱、γ變形菌綱、梭菌目、丹毒絲菌目、擬桿菌屬、Turicibacter、狹義梭菌屬1、Ruminococcaceae UCG-013相對豐度顯著減少(P<0.01)。見表2。

表2 優化潰結方治療前后門、綱、目、科、種、屬水平菌類比較 n=6,×10-4,

2.5 2組腸道穩態菌屬比較 模型組和正常組腸道穩態菌屬差異排名前9位的屬水平 OTU分別為糞桿菌(Faecalibacterium)、經黏液真桿菌屬(Blautia)、狹義梭菌屬1(Clostridium sensustricto 1)、異桿菌屬(Allobaculum)、Ruminococcaceae.UCG.013、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、擬桿菌(Bacteroides)、乳酸菌(Lactobacillus)、羅姆布茨菌(Romboutsia)。優化潰結方組和模型組腸道穩態菌屬差異排名前9位的屬水平OTU分別為糞桿菌屬、經黏液真桿菌屬、狹窄梭菌屬1、Ruminococcaceae.UCG.013、擬桿菌屬、異桿菌屬、蘇黎世桿菌屬、羅姆布茨菌屬、乳酸菌屬。優化潰結方組和柳氮磺胺吡啶陽性藥組腸道穩態菌屬差異比較排名前9位的屬水平OTU分別為治療后糞桿菌屬、經黏液真桿菌屬、狹窄梭菌屬1、異桿菌屬、擬桿菌屬、Ruminococcaceae.UCG.013、蘇黎世桿菌屬、羅姆布茨菌屬、乳酸菌屬。優化潰結方組羅姆布茨菌屬、異桿菌屬、蘇黎世桿菌多于柳氮磺胺吡啶陽性藥組。見圖4～7。

圖4 模型組和正常組穩態菌屬比較

圖5 柳氮磺胺吡啶組和優化潰結方組穩態菌屬比較

圖6 柳氮磺胺吡啶組和模型組穩態菌屬比較

圖7 優化潰結方組和模型組穩態菌屬比較

2.6 優化潰結方治療前后腸道菌群的微生物群落功能比較 根據KEGG二級功能預測,治療前后癌癥﹑碳水化合物代謝﹑心血管疾病﹑細胞通訊﹑其他氨基酸類的代謝﹑萜類和聚酮類的代謝﹑神經系統﹑神經退行性疾病﹑感覺系統﹑信號轉導﹑信號分子和相互作用﹑轉錄等信號通路比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 治療組治療前后 kegg pathway功能預測比較 n=6,

3 討論

UC是一種臨床常見疾病,主要影響著結腸的生理功能。微生物群門類水平中,厚壁菌門、擬桿菌門等在腸道中均有大量分布[12]。腸道微生物群可以參與不同的生理功能,如營養和能量供應,宿主防御以及宿主免疫調節[13]。

從本次研究來看,模型組和正常組的腸道穩態菌比較,糞桿菌、經黏液真桿菌屬、狹義梭菌屬1、異桿菌屬、羅姆布茨菌、瘤胃菌利UCG.013、蘇黎世桿菌屬顯著增加(P<0.05)、擬桿菌、乳酸菌出現了顯著減少(P<0.05)。UC氣滯血瘀模型SD大鼠,經優化潰結方治療后,腸道菌群屬水平OTU顯示,較治療前相比,乳酸菌顯著增加(P<0.05),乳酸菌被認為是腸道中有益細菌的一種,在健康的個體中數量豐富。在結腸炎癥階段,大量的乳酸菌明顯減少[4]。此外,經優化潰結方治療后,糞桿菌、狹義梭菌屬1、經黏液真桿菌屬、蘇黎世桿菌屬、異桿菌屬、擬桿菌屬、羅姆布茨菌屬、瘤胃菌科UCG.013 均顯著減少(P<0.05)。

糞桿菌普拉梭菌具有抗炎作用,維持細菌酶的活性,保護消化系統免受腸道病原體的侵害,有助于腸道穩態的微生物群的關鍵成員[14]。普拉梭菌可作為腸道健康的生物標志物。UC氣滯血瘀模型SD大鼠經優化潰結方治療后,腸道菌群屬水平OTU顯示,與治療前比較,普拉梭菌顯著增加(P<0.05)。Blautia和乳桿菌水平下降和疾病之間有較強的相關性,增加了Blautia和乳桿菌,可以產生保護腸道的抗菌物質如乳酸﹑短鏈脂肪酸,競爭獲取營養。蘇黎世桿菌屬和Clostridium_sensu_stricto_1被認為是條件致病菌與結腸炎有關。優化潰結方干預后,也顯著降低蘇黎世桿菌屬、Clostridium_sensu_stricto_1的相對豐度(P<0.05)。

此外,異桿菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌科UCG013、羅姆布茨菌屬與IBD的發生有直接關系[15]。異桿菌屬被認為與腸道宿主上皮密切相關[16]。瘤胃球菌屬能夠發酵復合糖類,產生乙酸酯、丙酸鹽以及具有抗炎效益的丁酸鹽。在擬桿菌屬中,克羅恩病和UC患者的擬桿菌屬豐度相較于常人明顯偏低。擬桿菌在活動性克羅恩病和UC患者中的減少程度比緩解期更明顯。經過優化潰結方治療后,腸道菌群屬水平OTU顯示乳酸菌數量大量增加,瘤胃球菌科UCG013和擬桿菌屬(Bacteroides)的產生有所降低。這種現象可能是由于乳酸菌和瘤胃球菌科UCG013之間的競爭導致了2個共同菌群的建立。乳酸利用菌數量的增加抑制了產甲烷的作用,從而導致了低甲烷排放和瘤胃球菌科UCG013的減少。

本項研究表明,UC氣滯血瘀模型SD大鼠導致糞桿菌、經黏液真桿菌屬、狹義梭菌屬1、異桿菌屬、Ruminococcaceae.UCG.013、蘇黎世桿菌屬、羅姆布茨菌等致病菌和產烷、產氣菌顯著增加,擬桿菌、乳酸菌等益生菌菌數出現了顯著減少,導致腸道菌群的紊亂;然而通過治療,優化潰結方增加了乳酸菌,降低了上述致病菌和產烷、產氣菌的水平,腸道炎癥恢復作用可能與優化潰結方的抗炎、調節腸道菌群作用密相關。