絞股藍(lán)總苷對(duì)人腦微血管內(nèi)皮氧糖剝奪的影響

解燕昭 楊梅柳 虞武 董立朋 趙景茹 陳彥霞

缺血性腦卒中致殘率高,幸存患者長期存在嚴(yán)重的身體和認(rèn)知功能障礙[1]。當(dāng)腦缺血后,腦組織氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡,細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化受抑制,ATP生成障礙,活性氧(reactive oxygen species,ROS)急劇增加,細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害,即產(chǎn)生氧化應(yīng)激,加快細(xì)胞凋亡、壞死等。ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可致血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接受損[2]、神經(jīng)損傷加重、腦梗死體積擴(kuò)大,而使用抗氧化劑治療可減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血腦屏障通透性、減少神經(jīng)細(xì)胞壞死[3],從而改善神經(jīng)功能損傷。中醫(yī)有關(guān)中風(fēng)的治療多強(qiáng)調(diào)活血通絡(luò)、醒神開竅等,已逐漸顯示出重要地位[4-7]。絞股藍(lán)是一種傳統(tǒng)中藥,絞股藍(lán)總苷具有很好的抗氧化作用[8],但筆者發(fā)現(xiàn)其在缺血性腦卒中的保護(hù)機(jī)制尚不明確。本研究通過氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)條件下培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC),模擬缺血性腦卒中的病理過程,并應(yīng)用絞股藍(lán)總苷進(jìn)行干預(yù),旨在探討其中的抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 HBMEC購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司,絞股藍(lán)總苷購自上海源葉生物科技有限公司,蛋白提取試劑盒購自美國Thermo;引物購自美國Promega公司。兔抗超氧化物歧化酶(SOD)單克隆抗體、兔抗編碼還原型輔酶/醌氧化還原酶[NAD(P)H:quinone oxido reductase,NQO1]單克隆抗體購自Abcam公司;β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;0.9%氯化鈉溶液購自石家莊第四制藥廠,DMEM 培養(yǎng)液購自美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;ROS試劑盒和DCFH-DA購自中國博奧森公司,熒光探針購自中國博奧森公司,CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司,PCR試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞OGD模型的建立及分組 HBMEC復(fù)蘇后,使用10%FBS的DMEM培養(yǎng),待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)期時(shí),將細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、OGD組、OGD+GP組。Control組為對(duì)照,HBMEC應(yīng)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h,OGD組為OGD組、OGD+GP組為OGD與絞股藍(lán)總苷干預(yù)組,2組均進(jìn)行OGD培養(yǎng)24 h,條件:無糖DMEM培養(yǎng)液,缺氧培養(yǎng)箱,37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、N2體積分?jǐn)?shù)95%、濕度97%。其中OGD+GP組,加絞股藍(lán)總苷100 mg/L共孵育細(xì)胞。

1.3 CCK-8測定細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性 按照說明書使用CCK-8測定HBMEC活力,將對(duì)數(shù)期生長的HBMEC接種于96孔板中,將不同濃度的絞股藍(lán)總苷:10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L放入相應(yīng)的孔中。在正常氧合培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液測定毒性。連續(xù)OGD 10 h后,用CCK-8測定藥物療效。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 熒光顯微鏡檢測ROS水平 DCFH-DA探針檢測HBMEC內(nèi)ROS水平,培養(yǎng)24 h后,吸出上清液,PBS清洗3次,在24孔板中加入DCFH-DA探針(10 μmol/L),置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min,立即用熒光顯微鏡觀察ROS熒光,采集圖像。

1.5 Western Blot檢測SOD、NQO1水平 各組HBMEC用RIPA裂解,提取總蛋白,13 000 r/min、4℃ 離心15 min。取50 μg蛋白,采用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),切膠后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,放入5%脫脂奶粉封閉液中,室溫封閉2 h,加入一抗,SOD(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000),室溫振搖1 h,后轉(zhuǎn)入4℃過夜。次日用TBST洗膜3次,5 min/次,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL顯色,將PVDF膜放置到凝膠成像分析系統(tǒng)中成像。

1.6 qRT-PCR檢測SOD、NQO1的mRNA水平 應(yīng)用Trizol試劑,提取總RNA,按說明書步驟提取組織中總RNA后并檢測總濃度,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(42℃,60 min,再于70℃,5 min),cDNA稀釋至50 μl,按照試劑盒說明書操作,檢測SOD、NQO1的mRNA水平,qRT-PCR檢測條件為95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃ 1 min;40循環(huán)。引物如下:SOD:5’-GGGCATCATCAATTTCGA-3’/5’-AGCCTGCTGTATTATCTCCA-3’;NQO1:5’-GAAGAGCACTGATCGTACTGGC-3’/5’-GGATACTGAAAGTTCGCAGGG-3’;β-actin:5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’/GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。

2 結(jié)果

2.1 確定絞股藍(lán)總苷的有效濃度 與Control組比較,5組絞股藍(lán)總苷濃度干預(yù)后HBMEC活力無明顯差異(P>0.05),提示5種濃度絞股藍(lán)總苷對(duì)HBMEC無明顯毒性。與OGD組比較,絞股藍(lán)總苷濃度為10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的干預(yù)后HBMEC活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。絞股藍(lán)總苷濃度為100 mg/L干預(yù)后細(xì)胞活力較高,因此選取絞股藍(lán)總苷濃度為100 mg/L作為有效濃度進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。見表1、2。

表1 不同GP濃度干預(yù)HBMEC的細(xì)胞活力 %,

表2 不同GP濃度干預(yù)OGD后HBMEC的細(xì)胞活力 %,

2.2 絞股藍(lán)總苷減少OGD后HBMEC的ROS產(chǎn)生 OGD組HBMEC的熒光強(qiáng)度較高,提示OGD后HBMEC發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),ROS水平升高,應(yīng)用不同濃度絞股藍(lán)總苷后,HBMEC的熒光強(qiáng)度較OGD組降低,尤其應(yīng)用絞股藍(lán)總苷濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L組的HBMEC熒光強(qiáng)度明顯降低,提示絞股藍(lán)總苷可降低HBME COGD后ROS水平。見圖1。

圖1 絞股藍(lán)總苷對(duì)氧糖剝奪后HBMEC中ROS表達(dá)的影響

2.3 絞股藍(lán)總苷上調(diào)OGD后HBMEC的SOD及NQO1蛋白表達(dá)水平 與Control組比較,OGD組SOD蛋白水平有降低的趨勢(shì),NQO1蛋白水平有上升的趨勢(shì),與OGD組比較,OGD+GP組HBMEC的SOD、NQO1蛋白水平均上調(diào)明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 絞股藍(lán)總苷對(duì)氧糖剝奪后HBMEC中SOD和NQO1蛋白圖

表3 絞股藍(lán)總苷對(duì)HBMEC中SOD和NQO1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 絞股藍(lán)總苷上調(diào)OGD后HBMEC的SOD及NQO1的mRNA表達(dá)水平 與Control組比較,OGD組SOD的mRNA水平有降低的趨勢(shì),NQO1的mRNA水平有上升的趨勢(shì),與OGD組比較,OGD+GP組SOD、NQO1的mRNA水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

氧化應(yīng)激在缺血性腦卒中的發(fā)病過程中起到重要的作用,抗氧化治療可有效保護(hù)神經(jīng)元,并減輕患者神經(jīng)功能損害。現(xiàn)代藥理證明絞股藍(lán)主要藥效成分為絞股藍(lán)總苷,具有多種效應(yīng),如防治血脂升高[9]、血糖升高、抑制腫瘤的生長、抗御神經(jīng)系統(tǒng)損傷、提高抵抗力、延緩衰老和固護(hù)肝臟等多種能效作用[9]。研究顯示,絞股藍(lán)總苷可降低患者體內(nèi)血漿脂質(zhì)過氧化物水平[10],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明絞股藍(lán)總苷可增強(qiáng)力竭運(yùn)動(dòng)小鼠抗氧化因子SOD的活性,達(dá)到保護(hù)組織免受自由基損傷的作用,保護(hù)心肌在缺血缺氧中的損傷[11],同時(shí)發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)對(duì)慢性腦缺血海馬神經(jīng)元具有較好的神經(jīng)保護(hù)功能[12]。HBMEC是血腦屏障最重要的組成部分,在腦梗死病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用,因此推測絞股藍(lán)總苷對(duì)可能通過降低HBMEC的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。

體外培養(yǎng)HBMEC,通過OGD模擬腦梗死缺血缺氧微環(huán)境,發(fā)現(xiàn)在缺氧缺糖條件下可導(dǎo)致HBMEC活性下降,應(yīng)用絞股藍(lán)總苷組,細(xì)胞失活狀態(tài)得到改善,本研究篩選出最佳藥物劑量為100 mg/L。研究顯示絞股藍(lán)總苷及其活性化合物在體外和體內(nèi)都能預(yù)防缺氧引起的損傷,減輕血腦屏障破壞[13]。在OGD條件下,用絞股藍(lán)總苷培養(yǎng)HBMEC,可明顯提升細(xì)胞的活力:內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障最主要的構(gòu)成部分,它的損傷可直接導(dǎo)致血腦屏障滲透性增加,根據(jù)上述推測絞股藍(lán)總苷可能在腦缺血缺氧后保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,從而發(fā)揮血腦屏障的保護(hù)作用。研究已表明血腦屏障的破壞與ROS引起的氧化應(yīng)激密不可分[14],據(jù)此進(jìn)一步檢測ROS表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在OGD條件下HBMEC的ROS水平明顯升高,而應(yīng)用絞股藍(lán)總苷后,ROS的表達(dá)降低,說明絞股藍(lán)總苷可通過降低ROS水平,減輕缺糖缺氧情況下內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激,從而保護(hù)HBMEC。

ROS可通過緊密連接中閉合蛋白的分布和表達(dá)破壞血腦屏障的完整,還可以激活介導(dǎo)血腦屏障功能障礙的下游通路影響其功能[15]。血腦屏障是最重要的生理屏障,由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其表面的緊密連接、周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和基底膜組成。血腦屏障通過調(diào)節(jié)體循環(huán)物質(zhì)的進(jìn)出來維持腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。血腦屏障的破壞時(shí)滲透性增加,是導(dǎo)致缺血性腦損傷加重的主要因素[16]。當(dāng)腦組織缺血缺氧時(shí),線粒體氧化磷酸化受抑制,細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生受限,能量依賴性的Ca2+泵、Na+泵不能及時(shí)將細(xì)及胞內(nèi)的Ca2+及Na+運(yùn)出,同時(shí)ROS水平會(huì)急劇增加,導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡、炎癥及壞死。ROS招募白細(xì)胞,刺激白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生粘附分子,引起細(xì)胞吞噬和免疫反應(yīng),炎性細(xì)胞積累,進(jìn)一步加重腦損傷[17],這一系列的級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡、神經(jīng)炎癥和血管破壞,進(jìn)而加重腦功能障礙[18]。本研究結(jié)果提示絞股藍(lán)總苷可通過降低ROS水平減輕HBMEC損傷,因此絞股藍(lán)總苷有可能減輕血腦屏障的破壞,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí),細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)也發(fā)生改變。研究顯示,心肌缺血再灌注損傷時(shí),使用絞股藍(lán)總苷預(yù)處理可保護(hù)心肌細(xì)胞活力,減少氧化應(yīng)激反應(yīng),保護(hù)心肌細(xì)胞;絞股藍(lán)總苷也可通過ROS表達(dá)減少,SOD表達(dá)增加降低氧化應(yīng)激水平[19,20]。因此我們推測絞股藍(lán)總苷可能提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化因素,短暫性腦缺血發(fā)作患者應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑后可提高SOD活力,通過減少脂質(zhì)過氧化物及減輕自由基介導(dǎo)的毒性,增加抗氧化能力,進(jìn)而改善腦缺血損傷后神經(jīng)功能缺損評(píng)分,促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)[21]。NQO1是還原型谷胱甘肽的合成限速酶,對(duì)抗氧化應(yīng)激能力的提高有重要作用[22],腦缺血后,NQO1表達(dá)明顯上升,減少ROS的形成,使細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)趨于平衡,減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。進(jìn)一步檢測HBMEC在不同條件下SOD及NQO1蛋白的情況,結(jié)果顯示在OGD時(shí)應(yīng)用絞股藍(lán)總苷,可提高內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化因子SOD及NQO1蛋白及mRNA的表達(dá),這說明能量缺乏時(shí),絞股藍(lán)總苷可在轉(zhuǎn)錄水平提高內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力。同樣也有研究顯示與野生型動(dòng)物相比,缺乏SOD的小鼠極易發(fā)生短暫性局灶性腦缺血,且血管源性水腫更嚴(yán)重,死亡率更高,SOD表達(dá)升高后可減輕腦缺血后血腦屏障損傷[23]。NQO1是人體Ⅱ相抗氧化酶和重要的抗氧化物質(zhì),可催化ROS的還原反應(yīng)[24],既往研究表明在缺血缺氧缺乏條件下內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NQO1升高,起到腦保護(hù)作用,結(jié)合我們研究結(jié)果表明應(yīng)用絞股藍(lán)總苷后上調(diào)NQO1表達(dá),從而發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述,絞股藍(lán)總苷可在OGD后通過降低ROS及上調(diào)抗氧化因子SOD及NQO1的表達(dá),調(diào)節(jié)HBMEC內(nèi)氧化應(yīng)激水平,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。