重組人生長激素治療對特發性矮小癥兒童血清Klotho和成纖維細胞生長因子23的影響

董涵涵 李蒙蒙 孫萌 周冉 張新穎 程亞穎

（河北省人民醫院兒科，河北石家莊 050051）

特發性矮小癥（idiopathic short stature, ISS）是矮身材兒童最常見的病因，研究表明ISS可能存在生長激素（growth hormone, GH）-胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor, IGF）-1軸損害［1］。成纖維細胞生長因子23 （fibroblast growth factor,FGF23）是一種通過調節鈣磷穩態進而促進骨形成的激素，主要由骨細胞和成骨細胞分泌，調節磷酸鹽重吸收和1,25-二羥維生素D3［1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25-(OH)2D3］的合成［2］。Klotho是一種在腎臟、脈絡叢和垂體前葉中高度表達的跨膜蛋白，在FGF23 對磷酸鹽轉運和骨化三醇產生中具有重要影響。研究發現敲除FGF23基因和敲除Klotho基因的小鼠均表現出礦物質代謝異常，以及與衰老相關的特征，包括壽命縮短、生長遲緩、性腺功能減退、認知障礙、骨質減少及骨骼肌萎縮等［3］。研究表明，Klotho 和FGF23 與GHIGF 軸密切相關［4］。Efthymiadou 等［5］關于生長激素缺乏癥（growth hormone deficiency, GHD）研究顯示，Klotho、FGF23 及IGF-1 與血清磷酸鹽均呈正相關，且FGF23 與Klotho、IGF-1 均呈正相關。Guarnotta 等［6］研究顯示，給予GHD 患兒重組人生長激素（recombinant human growth hormone, rhGH）治療12 個月后，Klotho、IGF-1 均較前明顯增高，Klotho 可與IGF-1、GH 聯合作為GHD 的標志物。但國內外ISS 患兒血清Klotho、FGF23 水平改變及其與線性生長的關系鮮有報道。本研究檢測rhGH治療前后ISS 患兒Klotho、FGF23 水平變化，以及其與身高標準差積分（height standard deviation of point, HtSDS）、磷酸鹽等的相關性，旨在初步探討ISS 患兒血清Klotho、FGF23 與GH-IGF-1 軸之間的關系，為ISS患兒的發病機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2021 年3 月10 日—2022 年12 月1日于河北省人民醫院兒科初次就診并完善相關檢查后確診為ISS 患兒33 例為研究對象，其中男18例，女15 例，年齡4.0～13.1 歲，平均7.6 歲。納入標準：（1）身高低于同性別、同年齡、同種族的健康兒童2 個標準差或處于第3 百分位數以下；（2）出生時身長及體重均在正常范圍內；（3）兩種作用機制不同的藥物GH 激發試驗（胰島素+左旋多巴）提示GH 峰值≥10 μg/L；（4）伴或不伴骨齡延遲。ISS 診斷依據《基因重組人生長激素兒科臨床規范應用的建議》［7］中相關診斷標準。

收集同期在我院兒童保健科健康體檢的健康兒童29 例作為健康對照組，其中男14 例，女15例，年齡5.1～13.8 歲，平均9.8 歲。納入標準：（1）年齡4～＜14歲；（2）身高處于同年齡、性別兒童正常范圍內；（3）近3個月內未使用任何激素類或促身高藥物；（4）無慢性肝腎病史、骨代謝疾病及近期骨折病史。

兩組共同排除標準：（1）臨床資料不完整；（2） 治療期間失訪；（3） 存在染色體異常；（4）患有其他基礎性疾病，如內分泌系統疾病、骨骼系統疾病、腎臟系統疾病、心血管系統疾病、遺傳代謝性疾病、心身障礙性疾病、營養不良等。

本研究已獲得兒童家長的同意并簽署知情同意書，并且已通過我院醫學倫理會審核批準，審批號為（2021）科研倫審第（24）號。

1.2 體格測量和性發育狀態評估

身高測量：由同一人在同一時間段（上午8:00—10:00）在同一臺儀器上對所有入組兒童進行身高測量。免冠，脫掉鞋子，囑患兒背向量尺，雙腳跟并攏，腳尖分開大約呈45°角站立，雙眼平視前方，枕部、背部、臀部及腳跟緊貼測量桿，測量者將測量儀器的水平板移到兒童的頭頂，適當地收緊，連續測量2次，取平均值，以cm為單位。

體重測量：由同一人在同一時間段（上午8:00—10:00）在同一臺儀器上對所有入組兒童進行體重測量。兒童穿單衣脫掉鞋子站于體重稱中間，待指針穩定后方可讀數，連續測量2 次取平均值，以kg為單位。

性發育狀態：采用Tanner 分期系統，根據乳房、外陰的發育及月經來潮等情況來評估女童，根據睪丸大小、陰莖、有無變聲、喉結等來評估男童［8］。

1.3 血清FGF23、Klotho、IGF-1測定及標準

所有受試者于清晨空腹狀態下采血，并留取血清冷凍于-80℃冰箱保存。血清FGF23 及Klotho水平均采用ELISA 原理測定。本實驗使用的人FGF23 ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司生產提供，靈敏度為0.78 pg/mL，精密度為批內變異系數（coefficient of variation, CV）＜8%，批間CV＜10%。人Klotho ELISA 試劑盒由北京四正柏生物科技有限公司生產提供，靈敏度為40.00 pg/mL，精密度為批內、批間CV均＜10%。

血清IGF-1通過化學發光免疫分析法檢測，使用的試劑盒及全自動化學發光測定儀來自于深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司，靈敏度為2.50 ng/mL，精密度為批內CV≤10%，批間CV≤15%，由我院核醫學科專業人員協助完成。IGF-1參考范圍：1～5 歲為45～305 ng/mL；6～10 歲為50～410 ng/mL；11～15歲為80～900 ng/mL。

1.4 資料收集

收集兩組兒童的資料。（1）一般資料：年齡、性別、年生長速率、身高、體重、體重指數（body mass index, BMI）、骨齡、性發育狀態、出生史（胎次、胎齡、出生體重、出生身長等）、喂養史、家族史（父母身高及性發育情況）、既往病史等，并計算HtSDS、體重標準差積分（weight standard deviation of point, WtSDS）、體重指數標準差積分（BMI-SDS）。為校正性別、年齡、地區間的差異，對身高、體重及BMI 加以標準化，更加快速準確地判斷該組兒童在所在參照人群中所處的位置。SDS=（實際測量值-同種族同年齡同性別人群平均值）/同種族同年齡同性別人群標準差［9-10］。（2）輔助檢查：血清磷酸鹽、血清鈣、25-羥維生素D、FGF23、Klotho、IGF-1等。

1.5 治療方法

ISS 組患兒均使用rhGH（注射用rhGH，長春金賽藥業有限責任公司，規格：4.0 IU/1.33 mg/1 mL）治療，劑量0.15～0.20 IU/(kg·d)，睡前半小時皮下注射。注意更換注射部位，并根據隨訪監測結果調整藥物劑量。分別在治療3、6、9個月時進行體格測量和生化指標評估。

1.6 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗；偏態分布的計量資料采用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。多個不同時間點數據符合正態分布及球形性假定采用單因素重復測量方差分析；對于不符合正態分布的數據采用Friedman非參數檢驗。計數資料采用例數和百分比（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Spearman 秩相關檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的一般資料及血清學指標比較

ISS組HtSDS、WtSDS、BMI-SDS低于健康對照（P＜0.05）。兩組年齡、性別、青春期前患兒比例，以及血清磷酸鹽、血清鈣、25-羥維生素D、IGF-1、Klotho、FGF23 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 ISS組和健康對照組一般資料及血清學指標比較

2.2 ISS 組不同治療時間點生長參數及血清學指標變化

ISS 組患兒rhGH 治療3、6、9 個月時HtSDS、IGF-1、Klotho 及FGF23 均明顯升高（均P＜0.001），且治療后，每個時間點與前一個時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05）。每3 個月的△HtSDS、△IGF-1 的變化值呈上升趨勢，治療3 個月時△HtSDS、△IGF-1 增高最為明顯（均P＜0.001）。治療前后BMI-SDS、每3 個月△WtSDS 及△BMISDS 的變化值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 ISS組不同治療時間點生長參數與血清學指標比較

2.3 ISS 組血清Klotho、FGF23 水平與相關參數的相關性

ISS 組患兒治療前Klotho 與FGF23、IGF-1、磷酸鹽呈正相關（分別rs=0.462、0.522、0.417，P＜0.05），Klotho 與HtSDS 無相關性（P＞0.05）。治療前FGF23 與IGF-1、磷酸鹽呈正相關（分別rs=0.348、0.360，P＜0.05），FGF23 與HtSDS 無相關性（P＞0.05）。rhGH 治療3、6、9 個月時，Klotho 與FGF23、IGF-1 呈正相關（分別rs=0.511、0.523、0.523，P＜0.05）， Klotho 與HtSDS 無相關性（P＞0.05）。rhGH 治療3、6、9 個月時，FGF23 與IGF-1 呈正相關（分別rs=0.365、0.366、0.503，P＜0.05），FGF23 與HtSDS 無相關性（P＞0.05）。見表3～6。

表3 治療前ISS組血清Klotho、FGF23水平與HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸鹽的相關性

表4 治療3個月ISS組血清Klotho、FGF23水平與HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸鹽的相關性

表5 治療6個月ISS組血清Klotho、FGF23水平與HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸鹽的相關性

表6 治療9個月ISS組血清Klotho、FGF23水平與HtSDS、IGF-1、Klotho及磷酸鹽的相關性

3 討論

Klotho基因在1997 年首次被發現，其表達缺陷與幾種過早衰老的表現有關，包括軟組織鈣化、皮膚萎縮、性腺發育不良、低血糖、嚴重高磷血癥、骨質疏松癥及壽命縮短等［11］。Klotho 主要在腎臟的遠端和近端腎小管、腦中的脈絡叢和甲狀旁腺中表達，但也在多種內分泌相關組織中少量表達，包括睪丸、卵巢和垂體［12］。據報道，在大鼠垂體瘤GH3細胞中，Klotho和堿性成纖維細胞生長因子共同作用來激活細胞外調節蛋白激酶1/2途徑，進而誘導GH 分泌［13］。在GH3 細胞系、培養的大鼠垂體和培養的人GH 分泌腺瘤中研究顯示，經過Klotho 治療后GH 分泌增加了約2 倍［14］。Rubinek 等［15］首次證明了IGF-1 直接促進Klotho 脫落進而調節Klotho分泌，這種作用是通過蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白途徑介導的。反過來，有研究證實Klotho能抑制小鼠肝細胞和心肌細胞中的胰島素和IGF-1 的分泌［16］。Sze 等［17］報道了24例肢端肥大癥患者的Klotho水平過高，經蝶竇手術后Klotho 水平恢復正常，GH 和IGF-1 水平也恢復正常。綜上所述，Klotho 可能在ISS 患兒的生長發育過程中發揮一定作用。

本研究顯示ISS 患兒血清Klotho 水平與正常兒童相比差異無統計學意義，經rhGH 治療后Klotho水平持續上升，3 個月時升高幅度最明顯。同時，IGF-1與Klotho呈現一致性變化，相關性分析顯示，治療前后IGF-1 與Klotho 呈明顯正相關，推測Klotho 在ISS 兒童中與GH-IGF-1 軸存在某種關聯。本研究中rhGh 治療后ISS 患兒身高HtSDS 明顯改善，同樣在前3 個月增高最顯著，但治療前后Klotho 與HtSDS 無相關性，Klotho 與磷酸鹽存在明顯正相關，提示Klotho 并非直接促進其線性生長，可能通過調節IGF-1 等其他途徑參與。Guarnotta等［6］及Rubinek 等［15］研究顯示GHD 患者血清Klotho 的倍數增加與IGF-1 的倍數增加相關。Coopmans 等［18］研究亦提示肢端肥大癥患者血清Klotho 和IGF-1 增長呈平行變化。在健康兒童中的研究也證實了這一點［19］。但Klotho 與GH-IGF-1 軸的具體機制有待進一步深入研究。

FGF23和Klotho介導的骨腎內分泌軸是磷酸鹽穩態的主要調節因子。FGF23是在小鼠的腦中首先被發現的［20］，通過連鎖分析發現導致FGF23 功能喪失的基因突變是引起常染色體顯性遺傳性低磷血癥性佝僂病和腫瘤誘導的骨軟化癥的原因［21-22］。FGF23 由成骨細胞和骨細胞合成并分泌到體循環中，作用于腎臟、甲狀旁腺、心臟、骨骼及其他器官［23］。在腎臟中，FGF23 通過下調近端小管的Na+偶聯磷酸鹽轉運體NaPi-Ⅱa 的膜豐度來抑制磷酸鹽的重吸收［24］。此外，FGF23 通過抑制腎臟中的25-羥維生素D 及1α-羥化酶來抑制1,25-(OH)2D3的合成［25］。FGF23 通過與FGFR1 受體結合發揮作用，并且需要Klotho作為輔助受體來增強其與受體的結合，從而參與FGF23 介導的信號轉導，促進磷酸鹽和鈣穩態的調節。骨骼生長需要正向的磷酸鹽平衡，GH/IGF-1 軸通過促進腎臟磷酸鹽的重吸收和骨化三醇的形成來提高血清磷濃度，而FGF23和Klotho通過抑制磷酸鹽重吸收而降低血磷水平，從而保持血磷穩定。FGF23、Klotho 與磷酸鹽、1,25-(OH)2D3及GH/IGF-1 軸存在緊密聯系，均在腎功能和磷酸鹽轉運中起著重要作用。因此，FGF23/Klotho軸對于正常的線性生長非常重要。

本研究顯示，ISS 患兒血清中FGF23 水平與正常兒童相比無明顯差異，經rhGH 治療后FGF23 水平均較前增高，且與Klotho、IGF-1 及血清磷酸鹽呈正相關。FGF23 與HtSDS 亦無相關性，這與Meazza 等［26］的研究結果一致。Klotho、FGF23 與HtSDS 無明顯相關性，提示Klotho、FGF23 可能并非直接促進ISS患兒的線性生長，而是通過其他途徑間接參與其生長發育。一項在98 例腎功能正常的兒童中的研究發現FGF23 與磷酸鹽、IGF-1 呈正相關［27］。另一項在健康兒童中的研究也顯示，血磷和腎小管最大磷吸收/腎小球濾過率與FGF23、Klotho呈正相關，Klotho與FGF23呈正相關［28］。在肢端肥大癥患者中的研究也發現，體內高水平的GH 及Klotho，會導致高水平的血清磷酸鹽存在［18］。本研究證實rhGH 治療可促進血清Klotho、FGF23、IGF-1 水平增高，均存在正相關。因此，Klotho、FGF23與GH/IGF-1軸共同調控磷酸鹽，在ISS兒童的線性生長方面發揮重要作用。

總之，rhGH 干預會促進ISS 患兒血清中Klotho、FGF23 水平的升高。血清Klotho、FGF23在ISS 患兒與IGF-1 相互作用，促進其追趕生長。Klotho、FGF23 與IGF-1 的一致變化表明三者在調節ISS線性生長中存在協同關系。

本研究的局限性是未對各組兒童性別、青春期狀態與血清Klotho和FGF23水平的相關性進行研究，缺少有關營養和運動的完整信息，且入組例數較少，需要擴大樣本量，延長隨訪監測時間，以獲取更多的臨床資料，為今后的研究工作提供更多的理論依據。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。