兒童原發(fā)免疫性血小板減少癥IL-37、VEGFA、TGF-β1的表達(dá)及其與T細(xì)胞的相關(guān)性研究

童琳琳 王立華 方芳 許彬 鄭素華

（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院小兒內(nèi)科，河北邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市傳染病醫(yī)院影像科，河北邯鄲 056001）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia, ITP）是一種臨床較為常見的免疫獲得性出血性疾病，可導(dǎo)致患者內(nèi)臟、皮膚及黏膜出血，嚴(yán)重時會對患者的生命安全造成威脅［1］。研究結(jié)果表明，ITP在兒童出血性疾病的病因中占比高達(dá)70%，而臨床上部分ITP患兒會隨疾病的進展演變?yōu)槁訧TP，需借助免疫抑制劑進行長期治療，預(yù)后較差，對患兒的身心健康造成嚴(yán)重影響［2-3］。因此，積極探討與兒童ITP 發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞因子具有重要意義。 白細(xì)胞介素-37（interleukin-37, IL-37）是自身免疫性疾病中炎癥反應(yīng)及先天免疫的天然抑制劑，但其是否參與ITP疾病的發(fā)生目前尚不明確［4］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）A 可通過影響病理性血管新生、介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移、增加血管通透性等諸多途徑，對血管生成依賴性疾病進行相應(yīng)調(diào)控［5］。 轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor, TGF）-β1 是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)最多的TGF-β，在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［6］。研究表明，機體免疫因子相關(guān)T細(xì)胞比例異常失衡，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell, Treg）/輔助性T 細(xì)胞17（helper T cell 17, Th17），是造成ITP 發(fā)生的重要因素［7］。然而，目前尚無有關(guān)ITP患兒IL-37、VEGFA、TGF-β1 的表達(dá)情況及其與T細(xì)胞的相關(guān)性研究報道?；诖?，本研究對45 例ITP 患兒治療前后的IL-37、VEGFA、TGF-β1 水平與Treg、Th17及Treg/Th17水平進行測定，探討IL-37、VEGFA、TGF-β1 水平對ITP 患兒發(fā)病與治療的影響，并分析相關(guān)機制。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取河北省邯鄲市中心醫(yī)院2020 年1 月—2022 年4 月收治的45 例ITP 患兒為ITP 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合兒童ITP的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；（2）年齡1～13 歲；（3）初次起??；（4）患兒監(jiān)護人知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料不完整者；（2）既往有血液疾病史者；（3）合并嚴(yán)重肝、腎等重要臟器功能不全者；（4）合并惡性腫瘤者；（5）合并嚴(yán)重精神疾病，無法配合研究進行者；（6）合并嚴(yán)重自身免疫疾病者；（7）繼發(fā)性血小板減少癥者。另選取同期健康體檢兒童30 例作為健康對照組。兩組兒童的年齡、體重指數(shù)、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），ITP組患兒血小板計數(shù)低于健康對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 治療方法與樣本采集

考慮丙種球蛋白等藥物可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)、樣本同質(zhì)性等因素，研究用藥均采用潑尼松進行［9］。ITP組患兒均給予潑尼松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司， 規(guī)格： 10 mg， 國藥準(zhǔn)字H20203398）口服，1.0～1.5 mg/kg，3 次/d，至血小板計數(shù)穩(wěn)定大于100×109/L 1～2 周后，逐步減停。根據(jù)實際臨床治療情況合并使用止血、抗感染等對癥治療。

采集健康對照組兒童（體檢時）和ITP組患兒治療前、潑尼松停藥后肘靜脈血4 mL，肝素鈉抗凝。

1.3 IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA檢測

應(yīng)用TRIzol 法（相關(guān)試劑購自美國Invitrogen公司）提取外周血中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，然后按照實時熒光定量PCR 試劑盒說明書進行各目的基因的實時熒光定量，試劑盒均購自大連TaKaRa 公司。最后應(yīng)用熒光定量PCR儀（美國ABI公司）對IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA 進行測定，并應(yīng)用2-△C法計算出IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平。

1.4 Treg與Th17檢測

選取肝素鈉抗凝血100 μL，加入2.5 μL Foxp3-APC、20 μL CD25-FITC 與20 μL CD4-FITC 單克隆抗體（單抗）并混合均勻，加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液并混合均勻，1 500 r/min 離心5 min 后棄除上層清液，加500 μL PBS 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對Treg 含量進行最終測定。另取100 μL 肝素鈉抗凝血用RPMI 1640培養(yǎng)液進行等體積稀釋，再加入刺激劑2 μL，放置在37℃水育箱中恒溫孵育5 h；將20 μL CD3-PC 與20 μL CD8-FITC 單抗混合均勻后加入，加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液混合均勻，離心機高速離心，10 000 r/min，5 min后棄除上層清液；加入250 μL 破膜劑固定，依次進行孵育、洗滌及離心，再次棄除上層清液并加入100 μL 洗滌緩沖液，加20 μ LIL-17A-PE單抗混合均勻，再次洗滌，高速離心5 min后再次棄除上層清液并加入500 μL PBS 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對Th17 含量進行最終測定。Foxp3-APC、CD25-FITC、CD4-FITC、CD3-PC、CD8-FITC 與IL-17A-PE 單抗，相關(guān)重懸細(xì)胞及流式細(xì)胞儀等均購自美國Becton Dickinson公司。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

選用SPSS 24.0 建立數(shù)據(jù)庫并進行數(shù)據(jù)分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較采用兩樣本t檢驗。計數(shù)資料以例和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，r代表相關(guān)系數(shù)，值越大代表相關(guān)性越強。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平

ITP 組患兒治療前后IL-37 mRNA 水平高于健康對照組（P＜0.001），VEGFA 及TGF-β1 mRNA 水平低于健康對照組（P＜0.001）。ITP 組患兒治療后IL-37 mRNA 水平低于治療前（P＜0.001），VEGFA及TGF-β1 mRNA 水平高于治療前（P＜0.001）。見表2。

表2 兩組IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平比較 （± s）

表2 兩組IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平比較 （± s）

注：［ITP］原發(fā)免疫性血小板減少癥；［IL-37］白細(xì)胞介素-37；［VEGFA］血管內(nèi)皮生長因子A；［TGF-β1］轉(zhuǎn)化生長因子-β1。

組別例數(shù)IL-37 mRNA VEGFA mRNA TGF-β1 mRNA t值P值t值P值t值P值治療前治療后治療前治療后治療前治療后ITP組t值P值34.435＜0.001 11.551＜0.001 31.253＜0.001 12.893＜0.001 45.071＜0.001 22.047＜0.001健康對照組45 27.408 30 1.04±0.08 2.07±0.15 26.889＜0.001＜0.001 27.000＜0.001-1.31±0.11 2.89±0.31 1.27±0.13-2.16±0.18 2.47±0.21 0.95±0.07-1.58±images/BZ_44_923_2798_926_2798.png0.14

2.2 治療前后Treg、Th17及Treg/Th17水平比較

ITP組患兒治療前后Th17水平高于健康對照組（P＜0.001），Treg、Treg/Th17 水平低于健康對照組（P＜0.001）。ITP 組患兒治療后Th17 水平低于治療前（P＜0.001），Treg、Treg/Th17 水平高于治療前（P＜0.001）。見表3。

表3 治療前后Treg、Th17及 Treg/Th17水平比較 （± s）

表3 治療前后Treg、Th17及 Treg/Th17水平比較 （± s）

注：［ITP］原發(fā)免疫性血小板減少癥；［Treg］調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；［Th17］輔助性T細(xì)胞17。

組別例數(shù)Treg (%)Th17 (%)Treg/Th17治療前治療后t值P值t值P值治療前治療后t值P值治療前治療后健康對照組ITP組t值P值14.131＜0.001 5.720＜0.001 16.989＜0.001 6.513＜0.001 28.140＜0.001 14.909＜0.001 30 45 7.6±2.2 2.9±0.5-5.3±1.4 0.6±0.1 2.3±0.5-1.1±0.4 11.314＜0.001 12.446＜0.001 13.414＜0.001 13.5±2.8 1.3±0.4-5.3±1.9

2.3 IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA 水平與Treg、Th17、Treg/Th17的相關(guān)性

健康對照組中IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平與Treg、Th17、Treg/Th17 無相關(guān)（P＞0.05）。ITP組患兒治療前后IL-37 mRNA水平與Treg、Treg/Th17呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Th17呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；ITP組患兒治療前后VEGFA、TGF-β 1 mRNA 水平與Treg 及Treg/Th17 均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與Th17 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表4～5。

表4 健康對照組IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平與Treg、Th17及Treg/Th17的相關(guān)性分析

3 討論

兒童ITP是以自發(fā)性出血及血小板數(shù)量減少等為主要特征的兒科常見出血性疾病，病毒感染是其最主要的致病因素，目前臨床治療以大劑量糖皮質(zhì)激素治療方案較為多用，療效顯著，一般預(yù)后良好［10-12］。但研究指出，20%～25%的ITP 患兒會進展為慢性ITP，存在一定的出血風(fēng)險，從而對患兒的生命安全構(gòu)成威脅［13-14］。研究表明，免疫因素與ITP 的發(fā)病機制有關(guān)，且國內(nèi)有研究表明，Treg 與Th17 及其分泌的細(xì)胞因子在機體內(nèi)表達(dá)異?？赡茉贗TP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。而目前對于ITP患兒細(xì)胞因子水平的發(fā)病機制暫無明確定論，仍需大量臨床研究加以探索，以期為日后臨床診治該疾病提供寶貴的指導(dǎo)性依據(jù)。

本研究中ITP 組患兒治療前后IL-37 mRNA 及Th17 水平均明顯高于健康對照組，VEGFA、TGFβ1 mRNA 及Treg、Treg/Th17 水平均明顯低于健康對照組；且與治療前比較，治療后ITP 組患兒IL-37 mRNA及Th17水平明顯下降，VEGFA、TGF-β1 mRNA 及Treg、Treg/Th17 水平明顯上升，提示IL-37表達(dá)在ITP患兒中異常升高，而VEGFA、TGF-β 1 表達(dá)在ITP 患兒中異常降低，IL-37、VEGFA 及TGF-β1可能通過對Treg、Th17及Treg/Th17進行調(diào)控，進而參與兒童ITP 的發(fā)生發(fā)展。IL-37 是一種常見的抗炎細(xì)胞因子。陳珍等［16］研究結(jié)果表明，IL-37 在ITP 患者中異常表達(dá)，可能通過調(diào)節(jié)機體的炎癥及免疫反應(yīng)來參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。Osborne 等［17］研究顯示，IL-37 高表達(dá)可抑制T 細(xì)胞活化與增殖。Geindreau 等［18］指出，VEGF 可通過直接相互作用和間接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞上的蛋白質(zhì)表達(dá)或血管通透性，進而參與先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)控。VEGFA 是VEGF 家族中重要成員，在慢性ITP 患兒T 細(xì)胞樣本中表達(dá)水平明顯下降，有較大的可能性成為ITP診斷及預(yù)后評估的生物標(biāo)志物［19］。TGF-β1對免疫細(xì)胞的發(fā)育和成熟、維持免疫耐受和體內(nèi)平衡及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的各個方面都至關(guān)重要［20-21］。動物實驗研究結(jié)果表明，TGF-β 1通過與抗血小板抗體結(jié)合，可以促進反應(yīng)性T 細(xì)胞的增殖與活化，引起Treg 免疫抑制功能降低，造成免疫平衡異常紊亂，使血小板遭受更加嚴(yán)重的破壞［22］。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ITP組患兒治療前后IL-37 mRNA 水平與Treg、Treg/Th17 均呈顯著負(fù)相關(guān)，均與Th17呈顯著正相關(guān)；ITP組患兒治療前后VEGFA、TGF-β1 mRNA 水平與Treg、Treg/Th17 均呈顯著正相關(guān)，均與Th17 呈顯著負(fù)相關(guān)。進一步證實IL-37、VEGFA 及TGF-β1 的表達(dá)水平與Treg、Th17、Treg/Th17 存在明顯關(guān)聯(lián)，這可能是造成ITP 患兒體內(nèi)Treg/Th17 比例失衡的重要因素，IL-37、VEGFA及TGF-β1均是臨床治療ITP患兒的潛在靶點。由于本研究屬單中心隊列研究，存在樣本量少、樣本區(qū)域代表性強等特點，故仍需通過多中心大樣本量研究對本研究結(jié)論作進一步佐證。

綜上所述，IL-37、VEGFA、TGF-β1 在兒童ITP中存在異常表達(dá)，且與Treg/Th17比例失衡有明顯關(guān)系，推測IL-37、VEGFA、TGF-β1等細(xì)胞因子可能參與ITP 的發(fā)生發(fā)展，或可成為治療兒童ITP的重要潛在靶點。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。