二代交叉引物恒溫擴增技術對結核分枝桿菌檢測的應用價值

王燕 歐維正 楊秀章 楊毅

(貴陽市公共衛生救治中心檢驗科,貴州 貴陽 550003)

結核病(TB)是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病。多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)作為快速分子診斷技術于2010年12月由WHO推薦[1],因其具有較高的靈敏性和特異性,操作簡便且快速,已在世界范圍內廣泛應用。交叉引物恒溫擴增技術(CPA)是一種新穎的環介導等溫擴增(LAMP)方法[2],也是我國首個具有自主知識產權的核酸擴增技術,相對Xpert MTB/RIF而言,CPA檢測MTB的臨床應用更具有價格優勢。一代CPA(恒溫擴增-試紙條法)被證明是一種簡便、快速、特異的MTB檢測方法[3],并已獲得WHO所認可[4],但因其手動處理步驟較多,限制了它在工作量大的臨床實驗室中的使用,主要推薦在基層實驗室開展[5]。后續發展的二代CPA(恒溫擴增-實時熒光法)則可實現了多通道“一管式”全自動核酸分析,即在一個密閉檢測管內完成核酸裂解結合、清洗、洗脫和擴增反應。因此,本研究旨在評估二代CPA作為TB的快速分子診斷技術的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年7月至2022年7月本院收治患者送檢的各類標本235例,其中,痰液98例、肺泡灌洗液76例、胸(腹)水37例、其它標本(穿刺液及分泌物等)24例。所有標本均經研究對象知情同意后獲得,排除標本不合格者、二代CPA和Xpert MTB/RIF檢測失敗者。

1.2試劑和儀器

1.2.1試劑 二代CPA檢測試劑為杭州優思達生物技術有限公司的“結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒(恒溫擴增-實時熒光法 )”[注冊號為國械注準20193401027 ];Xpert MTB/RIF檢測試劑為美國Cepheid公司的“Gene Xpert?MTB/RIF試劑盒”[注冊號為國食藥監械(進)字2014第3401153號]。

1.2.2儀器 UC0108核酸擴增檢測分析儀(杭州優思達生物技術有限公司)、Gene Xpert?檢測系統(美國Cepheid公司)等。

1.3檢測方法

1.3.1Xpert MTB/RIF檢測 取不少于2 mL標本置于有螺旋蓋的前處理管中,然后加入相當于1～2倍標本體積的處理液,旋緊前處理管,在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s,室溫靜置15 min,使標本充分液化。打開反應盒,取2 mL處理后標本從加樣孔緩慢加入反應盒,然后將反應盒置于檢測模塊,儀器自動化檢測。反應結束后,檢測結果可直接在檢測系統窗口下觀察。

1.3.2二代CPA檢測 取用于Xpert MTB/RIF檢測后剩余液化標本1 mL加至1.5 mL離心管中, 14 170×g離心3 min,棄上清。同時將MTB-DNA提取液充分混勻,全部轉入MTB-內標管中,靜置10～20 s后,充分混勻至管底無可見紫色附著物。將混合液全部轉入已棄上清的標本離心管中,充分混勻至管底無可見附著物。最后將總混合液全部轉入MTB-全自動檢測管中,蓋好管蓋上機檢測。以試劑盒自帶的MTB-陽性/陰性對照作為外部質控。MTB檢測結果呈現典型S型擴增曲線(包括未到平臺期的S曲線),當MTB Tt≤40時,MTB為陽性;否則MTB為陰性(同時滿足內標檢測結果接受標準)。

1.4統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。Xpert MTB/RIF和二代CPA對不同標本類型的MTB陽性檢出率比較采用χ2檢驗,p<0.05為差異有統計學意義;二者的一致性比較采用Kappa檢驗,Kappa值0～0.20示極低的一致性,0.21～0.40示一般的一致性,0.41～0.60示中等的一致性,0.61～0.80示高度的一致性,0.81～1示幾乎完全一致。

2 結 果

2.1235例標本同步進行Xpert MTB/RIF和二代CPA檢測,Xpert MTB/RIF檢測MTB陽性率為43.38%(103/235),二代CPA檢測MTB陽性率為42.13%(99/235)。不同標本類型的MTB陽性檢出率比較見表1。

表1 Xpert MTB/RIF和二代CPA檢測各種標本類型的MTB陽性率比較

2.2二代CPA與Xpert MTB/RIF對235例標本檢測MTB的結果比較 二者對全部標本的陽性符合率88.35%,陰性符合率93.94%,總符合率91.49%,一致性比較,Kappa=0.83。

2.3Xpert MTB/RIF檢測結果為“MTB高”的標本有11例,為“MTB中”的標本有44例,為“MTB低”的標本有30例,上述標本二代CPA檢測均為MTB陽性;Xpert MTB/RIF檢測結果為“MTB 極低”的標本有18例,二代CPA檢測MTB陽性有6例,陰性有12例;Xpert MTB/RIF檢測結果為“MTB 未檢出”的標本有132例,二代CPA檢測MTB陽性有8例,陰性有124例。

3 討 論

有研究[6]中,LAMP、SAT和Xpert MTB/RIF一樣,對檢測MTB均表現出較高的靈敏性和特異性,明顯高于抗酸染色和羅氏培養等傳統方法,極大地提高了臨床標本的MTB檢出率。Xpert MTB/RIF是較為成熟的TB快速分子診斷技術,在長期的實踐中已得到了臨床的廣泛認可[7]。

本文結果顯示,不同標本類型間檢測MTB的陽性率比較,二代CPA和Xpert MTB/RIF差異均顯示無統計學意義(P>0.05)。全部標本的統計學比較,二者檢測MTB的結果也有著極高的一致性(Kappa=0.83)。表明應用二代CPA和Xpert MTB/RIF對胃吸液檢測MTB的靈敏性和特異性相似,與文獻[8]研究結果基本相符。

研究發現二代CPA和Xpert MTB/RIF對MTB含菌量較多的標本(Xpert MTB/RIF檢測結果為“MTB 低”及以上),二者檢測結果完全一致,差異主要表現在少數Xpert MTB/RIF檢測結果為“MTB 極低”或“MTB 未檢出”的標本,這可能與二者的最低檢出限值存在差異有關。一方面二者靶基因不同,二代CPA的靶基因是IS6110,屬多拷貝基因,而Xpert MTB/RIF的靶基因是rpoB,屬單拷貝基因。有文獻[9]報道,以單拷貝基因為檢測靶基因的方法比以多拷貝基因為檢測靶基因的方法敏感性低。本文結果顯示,二代CPA比Xpert MTB/RIF的陽性率略低(42.13% vs 43.38%),這或許與本研究的標本量不夠大有關。另一方面二者自動化操作有差異,二代CPA多一步上機前標本離心富集的手工過程,如果該步驟處理不當,可能反而會導致菌量的丟失,這或許是本研究二代CPA比Xpert MTB/RIF陽性率低的另一原因。熟練掌握二代CPA的標準操作規程,將有益于提高二代CPA的檢測質量。

二代CPA和Xpert MTB/RIF都具有操作簡便、高度自動化的優勢,整個過程不到2 h,而二者檢測MTB的結果具有極高的一致性,因此,二代CPA同Xpert MTB/RIF一樣可推薦用于臨床對MTB的快速檢測。但Xpert MTB/RIF可以同時檢測利福平耐藥性則是它的另一大優勢。就檢測成本而言,二代CPA明顯低于Xpert MTB/RIF,二代CPA更適合在經濟欠發達地區推廣應用。