HPLC-ELSD測定靈芝孢子油中8個甘油三酯類成分的含量

郭 原，朱米群，錢一帆，溫明皓，陸宇婷，宋 敏，杭太俊*

1南京中科藥業有限公司，南京 211102；2中國藥科大學 藥物分析系，南京 210009

靈芝孢子粉由多孔菌科真菌赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]的干燥成熟孢子制得[1]。靈芝孢子油（ganoderma lucidum spore oil，GLSO）是靈芝孢子破壁后，經超臨界CO2流體萃取得到的脂肪油，GLSO 主要以甘油三酯（triglycerides，TGs）形式存在，同時還含有少量游離脂肪酸和類固醇酯[2，3]，具有抗炎、抗氧化、增強免疫力、抗癌等功效[4-7]。其中，TGs 主要包括1，2-二亞油酸-3-油酸甘油酯（1，2-linolein-3-olein，LLO）、1，2-二亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯（1，2-linolein-3-palmitin，LLP）、1，2-二油酸-3-亞油酸甘油酯（1，2-dioleoyl-3-linolein，OOL）、三油酸甘油酯（triolein，OOO）、1，2-二油酸-3-棕櫚酸甘油酯（1，2-olein-3-palmitin，OOP）、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯（1，2-olein-3-stearin，OOS）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯（1-palmitin-2-olein-3-linolein，POL）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-硬脂酸甘油酯（1-palmitin-2-olein-3-stearin，POS）等[8]，脂肪酸主要有油酸、亞油酸、棕櫚酸[9]等。靈芝孢子油質量標準暫未收錄于各國藥品標準中。《浙江省靈芝孢子粉炮制規范》[1]以乙腈-異丙醇（51∶49）為流動相，蒸發光散射檢測測定靈芝孢子粉中TGs 的液相指紋圖譜；有研究[10-12]以乙腈-異丙醇為流動相（不同比例）等度洗脫，分離靈芝孢子油中的各類TGs 成分。但這些方法所需分析時間均較長（約60 min），樣品分離效能低。本研究利用超高效液相色譜法（UPLC），以乙腈-無水乙醇-甲基叔丁基醚為流動相等度洗脫，顯著提高了HPLC-ELSD檢測靈芝孢子油中甘油三酯類成分含量的效率。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

靈芝孢子油軟膠囊（南京中科藥業股份有限公司，批號：20220418、20220802、20220902、20220928、20221008、20221018、20221125）；對照品：LLO（批號：V067∶12）、LLP（批號：X867∶12）、OOL（批號：Y094∶2）、OOO（批號：Y479∶7）、OOP（批號：Y103∶2）、OOS（批號：X510∶9）、POL（批號：Y595∶9）、POS（批號：Y578∶9）均購自瑞典Larodan AB 公司（純度＞99%）；乙腈、無水乙醇、甲基叔丁基醚均為HPLC 級（德國Merck 公司）。

1.2 儀器

Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱、1260 Infinity 型高效液相儀、1260 Infinity 型蒸發光散射檢測器（美國Agilent 公司）、BT25S 分析天平（德國Sartorius 公司）等。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

取各甘油三酯對照品適量，精密稱定，分別用流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含2.5 mg的溶液，作為各對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液適量，分別用流動相定量稀釋制成每1 mL 含LLO、LLP、OOS、POS 約20 μg，OOL、POL 約50 μg，OOO、OOP 約100 μg 的各對照品溶液。

分別精密量取各對照品儲備液適量置同一量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1 mL 中含LLP、POS、LLO、OOS 約50 μg，OOL、POL 約120 μg，OOO、OOP 約250 μg 的混合溶液，作為混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液適量，加流動相定量稀釋制成每1 mL 含LLP、POS、LLO、OOS 約20 μg，OOL、POL 約50 μg，OOO、OOP 約100 μg 的混合對照品溶液。

取本品內容物適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含600 μg 的溶液，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2 高效液相色譜條件

以Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm ×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱；以乙腈-無水乙醇-甲基叔丁基醚（45∶45∶10）為流動相，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為25℃，進樣量10 μL；蒸發光散射檢測器參數為霧化器/漂移管溫度70℃，氮氣流速1.20 L·min-1。

2.3 專屬性與色譜系統適用性試驗

精密量取“2.1”項下各對照品溶液、混合對照品溶液及供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果（圖1）表明以OOO 為對照，LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的相對保留時間（relative retention time，RRT）分別約為0.61、0.64、0.78、0.81、1.00、1.04、1.34、1.40，峰形對稱性和分離度良好，空白溶劑對各甘油三酯測定無干擾，且各甘油三酯分離度大于1.5，理論塔板數按OOO 計算不低于3000，該方法專屬性和系統適用性良好。

圖1 空白溶劑（A）、定量限溶液（B）、混合對照品溶液（C）及供試品溶液（D）中甘油三酯的HPLC-ELSD 色譜圖

2.4 線性和范圍

分別精密量取各對照品儲備液適量置同一量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1 mL 中約含各甘油三酯4、10、20、50、100、200 μg 的系列混合對照溶液。精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各甘油三酯的峰面積對數（lgA）為Y，對其質量濃度對數（lgC，μg·mL-1）為X 進行線性回歸。結果（表1）表明，其蒸發光散射響應均在約4.0～200 μg·mL-1濃度范圍呈現良好的線性關系（r ＞0.999）。不同組分色譜響應線性回歸分析的斜率均約為1.5，因此，在建立的色譜條件下，各組分的響應因子相當。在對照品不齊全的情況下，可以采用主成分為對照，外標峰面積法直接估算各組分的含量。

表1 8 種甘油三酯的校正曲線

2.5 定量限

以各成分標準曲線的濃度下限（40 μg·mL-1）為其定量限，實驗測得LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的濃度分別在約為3.79、4.24、4.27、4.59、4.09、4.36、4.34、3.73 μg·mL-1的情況下，各組分的色譜響應信噪比均大于10（圖1）。

2.6 溶液穩定性

取供試品溶液和50 μg·mL-1質量濃度水平混合對照溶液，在室溫下分別放置約30 h，于放置不同時間點精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以“2.4”項下各曲線標準計算各甘油三酯濃度。結果不同時間點測得溶液中各甘油三酯的濃度結果一致（RSD 均小于2.0%），表明該供試品和對照品溶液在室溫放置30 h 內均穩定（表2～3）。

表2 甘油三酯混合對照品溶液穩定性（μg·mL-1）

表3 靈芝孢子油供試品溶液穩定性（μg·mL-1）

2.7 加樣回收率試驗

本底溶液：取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含300 μg 的溶液，過濾，取續濾液。

加樣回收率試驗溶液：取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋成儲備液，精密量取適量，置10 mL 量瓶中，分別精密加入“2.1”項下混合對照品儲備液1.0、2.0 或3.0 mL，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為低（50%）、中（100%）、高（150%）濃度的溶液。低、高濃度各3 份，中濃度6 份。

精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按標準曲線法計算各甘油三酯的濃度，扣除樣品中的本底濃度，即得各甘油三酯對照品濃度，與加入濃度相比分別計算加樣回收率。結果表明，LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的平均加樣回收率均在96.63%～107.53%，RSD 均小于5.0%。根據《中華人民共和國藥典》（2020 年版）通則9101[13]中回收率限度的規定，本品屬于基質復雜及多成分范疇，同時采用了檢測響應靈敏度相對較低的蒸發光散射檢測器，回收率限度可適當放寬，故本法準確度良好。

2.8 進樣精密度

取“2.1”項下混合對照品溶液，照“2.2”項下條件連續進樣6 次，記錄色譜圖。結果表明，各成分保留時間的RSD 均小于1.0%；濃度的RSD 分別為0.55%、1.71%、0.52%、0.33%、0.48%、0.25%、0.55%和1.09%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.9 重復性

取“2.7”項下中濃度（100%）試驗溶液6 份，照“2.2”項下方法進行測定。按標準曲線法計算各甘油三酯的濃度，扣除樣品中的本底濃度，即得各甘油三酯對照品濃度，與加入濃度相比分別計算加樣回收率。

結果表明，各甘油三酯的平均加樣回收率為96.32%～106.01%（RSD ＜2.0%）范圍。根據《中華人民共和國藥典》（2020 年版）通則9101[13]中精密度可接受范圍的規定，本品屬于基質復雜及多成分范疇，同時采用了檢測響應靈敏度相對較低的ELSD檢測器，重復性RSD 范圍可適當放寬。故本法重復性良好（表4）。

表4 靈芝孢子油中甘油三酯重復性試驗結果

2.10 樣品測定

精密量取“2.1”項下供試品溶液及“2.5”項下系列混合對照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各甘油三酯的峰面積對數（lgA）為Y，對其質量濃度對數（lgC，μg·mL-1）為X 進行線性回歸，按標準曲線法計算各甘油三酯的含量。

結果（表5）表明，不同批次的靈芝孢子油中的甘油三酯總量相對均一，但各甘油三酯成分的含量，由于受藥材的產地或采收時期等因素影響而有所差異，其中相對含量較低的OOS（RSD 8.23%）和LLP（RSD 9.95%）含量波動略顯著。

表5 靈芝孢子油中甘油三酯含量測定結果（mg·g-1）

3 討論

本研究在非水反相色譜（nonaqueous reverse phase chromatography，NARP）流動相體系中加入甲基叔丁基醚，利用其強洗脫性，顯著加快樣品洗脫速度，同時以Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm)為色譜柱，相比于常規ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）填料粒徑更小，有利于降低渦流擴散及改變傳質路徑，提高柱效，并有效地縮短分析時間和減少溶劑消耗，更加綠色環保[14，15]。

本研究建立了一種靈芝孢子油中8 個甘油三酯類成分含量的HPLC-ELSD 法，具有專屬性好、分析洗脫時間適宜、定量準確等優點，滿足了靈芝孢子油中甘油三酯類成分質量控制的要求，也可適用于其他植物油脂中甘油三酯的測定。

在建立的ELSD 為檢測器的色譜條件下，不同甘油三酯類成分的響應因子相當。在對照品不齊全的情況下，可以采用主成分為對照的外標峰面積法直接估算各組分的含量。