基于IL-13/STAT6信號通路研究祛風宣痹方對哮喘氣道黏液高分泌的影響*

喻柯瑤，史瀟璐，王博寒，張曉娜，湯玲玲，孫憲泓，劉 麗，徐艷秋

1南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029；2南京市江寧中醫院，南京 210000

氣道黏液高分泌導致的氣道阻塞是哮喘發病過程中的關鍵環節，也是導致哮喘患者發病和死亡的重要因素[1]。因此，靶向治療氣道黏液高分泌成為減少哮喘發作頻率和延緩其進展的重要途徑。氣道黏液是由水、糖類、脂質、黏蛋白等所組成的混合物，其中黏蛋白是氣道黏液最主要的成分，黏性蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是氣道黏液中最主要的黏蛋白[2，3]。有研究表明[4]，MUC5AC 黏蛋白基因與哮喘的關系最為密切，在氣道炎癥刺激的情況下，MUC5AC基因表達上調，哮喘患者氣道黏蛋白MUC5AC 分泌過度，痰液阻塞氣道，引起患者氣道通氣功能障礙、纖毛清除功能下降、炎癥加重、氣道重塑等，是推進氣道炎癥持續進展、哮喘反復發作和遷延不愈的重要病理階段。相關研究表明[5]，白細胞介素-13（interleukin 13，IL-13）通過激活信號轉導和轉錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）形成的IL-13-STAT6-MUC5AC 黏液分泌通路，與哮喘氣道黏液高分泌狀態密切相關。

祛風宣痹方（平哮合劑）是江蘇省中醫院院內制劑，臨床實踐證明其能夠有效治療和控制哮喘的發作[6]。前期研究表明[7]，祛風宣痹方能夠改善哮喘小鼠病理反應，減少哮喘小鼠的肺組織嗜酸性粒細胞、炎癥細胞浸潤，下調炎癥因子IL-4、IL-13、IL-17 及IgE 水平，調節T 細胞平衡等。本實驗通過建立以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的哮喘小鼠模型和IL-13 誘導的A549 細胞黏液分泌病理模型來探討祛風宣痹方對氣道黏液分泌及IL-13/STAT6信號通路的影響。

1 實驗材料

1.1 動物與細胞

清潔級雌性Balb/c 小鼠24 只，6～8 周齡，體質量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK（上海）2017-0005，實驗動物使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0069，飼養于南京中醫藥大學附屬醫院SPF 級動物實驗室，室溫20～24℃，相對濕度45%～50%。A549 細胞購于中國科學院細胞資源中心。

1.2 倫理審查

本研究經南京中醫藥大學附屬醫院動物實驗倫理委員會審批通過，批件編號為2021 DW-07-02。

1.3 試驗藥物

祛風宣痹方（QFXBF）：射干10 g，炙麻黃6 g，制僵蠶10 g，瓜蔞10 g，薤白10 g，海風藤20 g，白芍15 g，炙甘草5 g，葶藶子10 g，蛤殼20 g，桃仁10 g，苦杏仁10 g，地龍10 g，黃芩10 g，蛇床子10 g。飲片購于江蘇省中醫院。所有飲片分次煎制、濃縮至原藥材濃度為1.66 g·mL-1煎劑，4℃保存備用。祛風宣痹方凍干粉由上海中醫藥大學中藥現代制劑中心制作，每克凍干粉相當于原藥材5.32 g，使用時以RPMI 1640 細胞培養基稀釋至相應濃度用于細胞實驗。

1.4 主要試劑與儀器

卵清蛋白（美國Sigma 公司）；氫氧化鋁凝膠（中國醫藥集團有限公司）；IL-13（派普泰克生物科技有限公司）；RMI 1640 培養基、胎牛血清（德國BI 公司）；青霉素-鏈霉素溶液（美國ThermoFisher Scientific 公司）；IL-13 ELISA 檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；STAT6 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；p-STAT6 抗體、β-actin 抗體（美國Affinity Biosciences 公司）；MUC5AC 抗體（美國Abcam 公司）；兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；MTT（上海碧云天生物技術有限公司）；熒光二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）。

HERA cell 1501 CO2細胞培養箱（美國ThermoFisher Scientific 公司）；ELX -800 酶標儀、041BR142554 蛋白電泳儀、L520 CHEMIDOC XRS+凝膠成像系統（美國Bio-Bad 公司）；Heraeus Fresco21 離心機（德國Eppendorf 公司）；CKX41 倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；ECLIPSE Ts2R-FL 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 實驗方法

2.1 動物造模、分組及給藥

24 只小鼠隨機分為對照組、哮喘組和祛風宣痹方組，每組8 只。在第0 天和第14 天，哮喘組、祛風宣痹方組的小鼠通過腹腔內注射200 μL 濃度為0.5 mg·mL-1的OVA 和氫氧化鋁混合液致敏。在第14、25、26 和27 天，小鼠鼻內給藥OVA 溶液50 μL（2 mg·mL-1），對照組使用同等體積生理鹽水。小鼠在滴鼻前呼吸平穩，滴鼻過程中出現撓鼻、咳嗽、煩躁、呼吸加快等表現，激發后2 min 內咳嗽次數增多表明造模成功。第14 天至第27 天之間，祛風宣痹方組小鼠每天灌胃給予祛風宣痹方一次（25 g·kg-1）[7]，對照組和哮喘組小鼠接受生理鹽水0.2 mL。

2.2 細胞培養、分組及藥物干預

A549 細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640、100 mg·L-1鏈霉素和100 mg·L-1青霉素的培養基養在培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞融合達70%～80%時用胰蛋白酶消化進行實驗。

將A549 細胞以5000 個/孔接種于96 孔板，予不同濃度祛風宣痹方（37.5、75、150、300、600 μg·mL-1）干預24 h 后，加入MTT（5 mg·mL-1）溶液10 μL，培養箱孵育4 h，棄去MTT 液，每孔加入DMSO 150 μL，避光低速振蕩10 min，酶標儀測定每孔在490 nm 處的吸光值（A），按公式（A實驗組-A對照組）/A對照組×100%計算細胞活力，篩選祛風宣痹方最佳作用濃度。

將A549 細胞以5000 個/孔接種于96 孔板，分為對照組（完全培養基）、IL-13 組（IL-13 終濃度50 ng·mL-1）、IL-13+祛風宣痹方組（IL-13 終濃度50 ng·mL-1，祛風宣痹方終濃度300 μg·mL-1）和祛風宣痹方組（祛風宣痹方終濃度300 μg·mL-1），分別處理24 h。

2.3 標本采集

實驗結束后，稱量小鼠體質量，麻醉后摘眼球取血，用于檢測血清中IL-13 水平。剪開胸腔，分離氣管，將肺組織置于4%中性甲醛溶液固定后進行HE、PAS 染色和MUC5AC、p-STAT6 免疫組化實驗。

2.4 指標檢測

2.4.1 肺組織病理學觀察 肺組織經固定、脫水、透明、石蠟包埋后切片。

HE 染色：切片常規脫蠟、水化后蘇木素染核，1%鹽酸酒精顯藍，酒精脫水，伊紅染細胞質，酒精脫水、二甲苯透明，自然風干，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

糖原PAS 染色：上述切片常規脫蠟至水，阿利新藍染色液染色，蒸餾水水洗，過碘酸溶液氧化，Schiff 試劑浸染，蘇木素染細胞核，酸性分化液分化，滴入Scott 藍化液反藍，水洗后酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、固定，光學顯微鏡下觀察氣道黏液分泌情況。

2.4.2 肺組織MUC5AC、p-STAT6 免疫組化染色石蠟包埋塊，切片，脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液沖洗，H2O2滅活內源性酶，蒸餾水、PBS 清洗，山羊血清封閉，加一抗，4℃孵育過夜。清洗后孵育二抗，DAB 顯色，蘇木精復染細胞核，脫水，透明，中性樹脂封片，應用Image J 軟件計算MUC5AC、p-STAT6 染色陽性結果平均光密度值。

2.4.3 ELISA 檢測 收集小鼠外周血，于4℃以4000 r·min-1離心10 min 取血清。參照IL-13 檢測試劑盒說明書步驟進行檢測，酶標儀波長450 nm 測量吸光度A，根據標準曲線回歸方程計算小鼠血清中IL-13 含量。

2.4.4 免疫熒光檢測 96 孔板培養24 h 的A549細胞，4%免疫熒光固定液30 min，10%的山羊血清封閉1 h，加入抗MUC5AC 抗體（1∶100）、抗p-STAT6 抗體（1∶100）4℃過夜。0.3%Triton 洗滌，二抗孵育1 h，DAPI 染色5 min，加入30 μL 抗熒光淬滅劑后熒光顯微鏡下拍照。用Image J 軟件分割通道得到8 bit 的黑白圖像，在一定的閾值下，分析其熒光強度（以灰度值代替）和面積。平均熒光強度即平均灰度值=積分灰度值/面積。

2.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析，GraphPad 9.0 軟件進行科研繪圖。免疫組化及免疫熒光計量數據以Image J 計算并導出。所有數據以（）表示，組間樣本均數比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠肺組織病理改變

各組小鼠肺組織病理改變結果（圖1）顯示，對照組小鼠肺組織、氣道黏膜上皮及肺泡結構相對完整。與對照組比較，哮喘組小鼠支氣管黏膜部分損失，氣道管壁周圍可見較多炎癥細胞浸潤；與哮喘組比較，祛風宣痹方組小鼠支氣管管壁形態趨于正常，支氣管周圍炎癥細胞浸潤減少。

圖1 對照組（A）、哮喘組（B）及祛風宣痹方組（C）小鼠肺臟組織HE 染色圖（×200）

3.2 各組小鼠氣道黏液物質的變化

PAS 染色可使多糖類及糖蛋白如黏蛋白MUC5AC 呈紫紅色[8]，黏蛋白MUC5AC 陽性呈紫紅色區。本實驗中，對照組小鼠氣道組織中幾未見紫紅色區域；哮喘組小鼠較多處區域呈現出紫紅色，說明氣道黏液分泌增多；祛風宣痹方組氣道黏液物質分泌可見明顯減少（圖2）。

圖2 對照組（A）、哮喘組（B）及祛風宣痹方組（C）小鼠肺臟組織PAS 染色圖（×200）

3.3 各組小鼠肺組織中MUC5AC、p-STAT6 表達情況

鏡下觀察MUC5AC、p-STAT6 蛋白表達陽性細胞可呈黃色或棕黃色。結果顯示，正常組小鼠肺組織中幾未見MUC5AC 蛋白表達；哮喘組小鼠肺組織中可見MUC5AC 較高表達（P ＜0.05），祛風宣痹方組小鼠肺組織中棕黃色陽性表達較哮喘組明顯減少（P ＜0.05）。與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織中p-STAT6 蛋白陽性顆粒明顯增多（P ＜0.01）；與哮喘組相比，祛風宣痹方組p-STAT6 蛋白陽性顆粒則明顯減少（P ＜0.01）。見圖3、表1。

表1 各組小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白免疫組化平均光密度值表達結果（，n=3）

表1 各組小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白免疫組化平均光密度值表達結果（，n=3）

注：與OVA組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

圖3 對照組（A）、哮喘組（B）及祛風宣痹方組（C）小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白表達（×200）

3.4 各組小鼠血清中IL-13 的表達情況

與對照組相比，哮喘組小鼠血清中IL-13 含量明顯增高（P ＜0.01）；與哮喘組相比，祛風宣痹方組IL-13 含量顯著減少（P ＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-13 含量（ng·L-1，，n=4）

表2 各組小鼠血清中IL-13 含量（ng·L-1，，n=4）

注：與OVA組比較，**P ＜0.01。

3.5 不同濃度祛風宣痹方對A549 細胞活力的影響

結果顯示，與正常對照組比較，37.5、75、150、300 μg·mL-1[6]祛風宣痹方對細胞活力無顯著影響（P ＞0.05），而600 μg·mL-1祛風宣痹方則能降低A549細胞活力（P ＜0.05），提示過高濃度祛風宣痹方可能具有一定程度細胞毒性，因此選擇300 μg·mL-1進行后續實驗。見表3。

表3 不同濃度祛風宣痹方對A549 細胞活力的影響（，n=6）

表3 不同濃度祛風宣痹方對A549 細胞活力的影響（，n=6）

注：與對照組比較，**P ＜0.01。

表4 各組細胞中MUC5AC、p-STAT6 蛋白平均熒光強度變化（，n=3）

表4 各組細胞中MUC5AC、p-STAT6 蛋白平均熒光強度變化（，n=3）

注：與IL-13組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3.6 A549 細胞中MUC5AC、p-STAT6 表達情況

在免疫熒光染色中，A549 細胞胞漿中MUC5AC蛋白陽性呈綠色熒光。對照組細胞內MUC5AC 有少量陽性表達；IL-13 組MUC5AC 表達量明顯增多，且多于正常組及IL-13+祛風宣痹方組（P ＜0.05）。

A549 細胞核內p-STAT6 蛋白表達呈綠色熒光。與對照組比較，IL-13 組綠色熒光強度顯著增強（P ＜0.01）；與IL-13 組比較，IL-13+祛風宣痹方組細胞核內綠色熒光強度則有較為明顯的降低（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 對照組（A）、IL-13 組（B）、IL-13+祛風宣痹方組（C）及祛風宣痹方組（D）A549 細胞MUC5AC、p-STAT6 蛋白表達（×200）

4 討論

傳統醫學認為，哮喘屬于“哮證、喘證”的范疇，其基本病機為“痰伏于內”。氣道黏液高分泌狀態與中醫學的“伏痰”關系密切，二者有著共同的物質基礎“痰”。祛風宣痹方具有祛風宣痹、化痰通陽、肅肺平喘之功效，臨床療效表明，祛風宣痹方可有效緩解患者咳嗽痰鳴、胸悶等“伏痰于內”相關臨床表現[9]。因此，祛風宣痹方可能通過改善氣道黏液高分泌減輕哮喘發作。在本研究中，相較于哮喘組小鼠，祛風宣痹方組小鼠氣道黏液分泌明顯減輕，MUC5AC 蛋白表達也明顯降低；同時，祛風宣痹方能減輕A549 細胞MUC5AC 蛋白表達，證明祛風宣痹方可以通過抑制MUC5AC 的表達從而減少哮喘氣道黏液分泌。

IL-13 是一種主要由活化的Th2 細胞分泌免疫的調節細胞因子，被認為是哮喘發病過程中的關鍵介質[10]。相關文獻指出[11，12]，IL-13 在誘導哮喘包括氣道高反應性、黏液分泌增加等的病理特征中起重要作用。KIM S 等[13]的實驗表明，IL-13 可增加A549細胞中STAT6 的磷酸化以及MUC5AC mRNA 和蛋白的表達從而促進黏液分泌。

STAT6 是STAT 蛋白家族成員之一，STAT 蛋白可以被激活后的Janus 激酶（JAKS）磷酸化形成二聚體進入細胞核內，誘導相應基因的轉錄和表達[14]。JAK/STAT 途徑與哮喘的發生密切相關，而IL-13是STAT6 信號通路激活的重要信號因子[15]。IL-13可通過與IL-13Ra 亞基結合，形成IL-13Ra/IL4Ra受體復合物，激活JAK/STAT6 信號通路后引起STAT6 的磷酸化[16-18]。p-STAT6 進入細胞核誘導MUC5AC 基因轉錄與蛋白表達，導致哮喘的氣道黏液分泌增加。本實驗發現，祛風宣痹方能降低哮喘小鼠外周血中IL-13 水平及其肺組織中的p-STAT6 蛋白量，這與細胞實驗中p-STAT6 表達趨勢相一致。這表明祛風宣痹方可能是通過抑制IL-13/STAT6 通路的激活來減輕哮喘黏液過度分泌，從而緩解哮喘發作。

綜上所述，祛風宣痹方能通過抑制哮喘黏液高分泌，從而治療哮喘。其機制可能與抑制IL-13/STAT6 通路的表達相關，進一步的機制探索還需課題組展開后續實驗，以期為臨床提供更多實驗依據。