基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究男寶膠囊中人參投料摻偽*

薛 平，汪嘉麗，王倬暄，李 莉，劉旻虹，顧崢嶸，黃強(qiáng)燕，潘璐艷

常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，常州 213000

男寶膠囊最早名為補(bǔ)腎膠囊，具有補(bǔ)腎壯陽、益精養(yǎng)血之功效，由鹿茸、牡丹皮、黃芪、人參、肉桂、枸杞子等31 味中藥組成，其內(nèi)容物為暗褐色粉末，味微咸，氣微弱，臨床上主要用于腎陽不足引起的性欲淡漠，陽痿滑泄，腰腿酸痛，腎囊濕冷，精神萎靡，食欲不振等癥[1]。

目前男寶膠囊的質(zhì)量控制方法主要是關(guān)于人參、肉桂和附子等藥味的薄層色譜鑒別[2，3]，淫羊藿苷、丹皮酚和金絲桃苷等成分的含量測定[4-6]，也有針對一家生產(chǎn)企業(yè)形成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案[7]，然而關(guān)于原料藥投料真實(shí)性的研究相對較少。

近年來多次報道人參中摻偽西洋參進(jìn)行含人參制劑的投料生產(chǎn)情況，其中將擬人參皂苷F11為西洋參中特征成分作為非法投料使用的檢驗(yàn)依據(jù)[8]。男寶膠囊是本中心承擔(dān)的國家藥品監(jiān)督管理局2022 年國家藥品抽驗(yàn)品種，針對上述監(jiān)管空白，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法探究男寶膠囊中人參的投料情況，制定合理的摻偽判定原則，為中成藥質(zhì)量控制和市場監(jiān)管提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

LCMS-8060 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津有限公司）；XP504 萬分之一電子天平、XP105DR萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（默克密理博有限公司）。

1.2 試藥與試樣

擬人參皂苷F11對照品（批號110841-202209，含量99.5%）和人參皂苷Rf 對照品（批號111719-201806，含量100%）均購自于中國食品藥品檢定研究院。

男寶膠囊樣品來源于全國30 個省級行政區(qū)，共涉及8 家生產(chǎn)企業(yè)（編號S1～S8），72 批次樣品。乙腈均為色譜純，甲醇為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件[8-10]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），行梯度洗脫：0 min（20∶80）→2 min（50∶50）→4.5 min（80∶20）；流速0.35 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；離子源接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：526℃；DL 管溫度：250℃；載氣流速：2.8 L·min-1；加熱器流量：10 L·min-1；加熱塊溫度：400℃；干燥氣流速：10 L·min-1；采集模式為負(fù)離子模式；各化合物監(jiān)測離子對和碰撞電壓（collision energy，CE）見表1。

表1 化合物質(zhì)譜測定條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 精密稱取擬人參皂苷F11對照品適量，加甲醇制成100 μg·mL-1的溶液，作為擬人參皂苷F11貯備溶液。精密稱取人參皂苷Rf 的對照品適量，加甲醇制成85 μg·mL-1的溶液，作為人參皂苷Rf 貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液 取男寶膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置25 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陽性對照溶液 按生產(chǎn)企業(yè)S5 的處方比例及工藝，制備含0%、3%、5%、10%、20%、50%和100%西洋參的陽性對照樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備系列陽性對照溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的含0%西洋參對照溶液、含100%西洋參陽性對照溶液和對照品溶液（擬人參皂苷F11和人參皂苷線性關(guān)系中第三個濃度點(diǎn)），按“2.1”項(xiàng)下條件各進(jìn)樣5 μL 分析，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）提取離子對色譜疊加圖見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0%對照溶液均未檢出擬人參皂苷F11，檢出人參皂苷Rf 色譜峰；含100%西洋參陽性樣品中檢出擬人參皂苷F11色譜峰，未檢出人參皂苷Rf 色譜峰，表明擬人參皂苷F11可作為男寶膠囊中西洋參摻偽的專屬性鑒別成分。

圖1 對照品溶液及對照溶液MRM 提取離子對色譜疊加圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取擬人參皂苷F11貯備溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為擬人參皂苷F11對照溶液。精密吸取人參皂苷Rf 貯備溶液5 mL，置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為人參皂苷Rf 對照溶液。

分別精密量取擬人參皂苷F11對照溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10.0 mL 置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制得擬人參皂苷F11系列對照品溶液。分別精密量取人參皂苷Rf 對照溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 置100 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制得人參皂苷Rf 系列對照品溶液。

按“2.1”項(xiàng)下條件將上述系列對照品溶液進(jìn)樣測定峰面積，以對照品濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得擬人參皂苷F11線性方程為Y=4.854×103X+1.575×103（r=0.999 4），線性范圍1.049～104.900 ng·mL-1；人參皂苷Rf 線性方程為Y=2.963×103X+4.392×103（r=0.998 9），線性范圍4.250～170.000 ng·mL-1。

2.5 定量限與檢測限

取線性關(guān)系中對照品溶液稀釋至一定的濃度，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。以信噪比為10∶1 時相應(yīng)濃度計算定量限，以信噪比為3∶1 時相應(yīng)濃度計算檢測限。定量限與檢測限均折算至樣品，擬人參皂苷F11定量限為0.087 μg·g-1，檢測限為0.035 μg·g-1；人參皂苷Rf 定量限為0.071 μg·g-1，檢測限為0.028 μg·g-1。

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取對照品溶液（擬人參皂苷F1110.487 ng·mL-1，人參皂苷Rf 42.000 ng·mL-1），按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)6 針，記錄峰面積。結(jié)果擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf 峰面積的RSD（n=6）為1.41%和1.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取男寶膠囊樣品（編號S6-4），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，測得擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf 平均含量分別為3.478 和24.601 μg·g-1，RSD 分別為6.98%和2.70%（n=6），結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取男寶膠囊樣品（編號S3-3），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h 內(nèi)按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf RSD 分別為5.29%和4.78%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取男寶膠囊樣品（編號S2-1，擬人參皂苷F11含量19.563 μg·g-1，人參皂苷Rf 20.288 μg·g-1）約1.5 g，分別精密加入擬人參皂苷F11貯備溶液0.3 mL，人參皂苷Rf 貯備溶液0.4 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，再按2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計算含量、回收率、平均回收率，結(jié)果（表2）表明本試驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.10 樣品含量測定結(jié)果

取不同生產(chǎn)企業(yè)的男寶膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述“2.1”項(xiàng)下條件分析，分別計算樣品中擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf的含量。

8 家生產(chǎn)企業(yè)共72 批次樣品，受篇幅限制測定數(shù)據(jù)不便于一一列出。故將測定結(jié)果以不同生產(chǎn)企業(yè)為單位，統(tǒng)計生產(chǎn)企業(yè)不同批次樣品中擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf 含量范圍與平均值，詳見表3。

表3 不同生產(chǎn)企業(yè)樣品含量測定結(jié)果（μg·g-1，n=2）

3 限度濃度的制定

8 家企業(yè)的男寶膠囊生產(chǎn)工藝均是部分原料水提+部分原料30%乙醇提+部分原粉入藥，其中人參均為水煎煮提取。對比各企業(yè)生產(chǎn)工藝，詳見表4（秉持對企業(yè)生產(chǎn)工藝保密原則，表4 僅列出涉及人參的處方量、制成量和水煎煮提取方式），發(fā)現(xiàn)上述生產(chǎn)企業(yè)之間存在細(xì)微的差異，7 家人參投料量完全一致，生產(chǎn)企業(yè)S3 的投料量稍有差異（800 g 膠囊內(nèi)容物的人參投料量為人參77.8 g），少了接近22%，但該生產(chǎn)企業(yè)的男寶膠囊中擬人參皂苷F11含量相對較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于擬定限度的78%（男寶膠囊樣品中擬人參皂苷F11含量為8.3 μg·g-1×78%=6.5 μg·g-1），該企業(yè)摻偽風(fēng)險低。考慮到成本、效率和方法的一致性，故統(tǒng)一制備陽性對照樣品，擬定西洋參摻偽限度。生產(chǎn)企業(yè)S5 的生產(chǎn)工藝（800 g 膠囊內(nèi)容物的人參投料量為人參100 g，煎煮3 次，第一次2 h，第二次1.5 h，第三次1 h）較為均衡兼顧，故參照生產(chǎn)企業(yè)S5 的生產(chǎn)工藝陽性對照樣品（模擬摻偽西洋參樣品）。

表4 8 家生產(chǎn)企業(yè)人參投料量與制得量生產(chǎn)工藝對比

3.1 摻偽比例考察

取“2.2.3”項(xiàng)下含0%、3%、5%、10%、20%、50%和100%西洋參的陽性對照樣品，按“2.1”項(xiàng)下條件測定，計算樣品中擬人參皂苷F11。陽性對照溶液的陽性對照樣品（模擬摻偽西洋參樣品）使用的西洋參來源為遼寧龍參健康藥業(yè)有限公司，批號211001，擬人參皂苷F11含量1.299×103μg·g-1。

測定結(jié)果（表5）顯示，當(dāng)摻入3%的西洋參時，樣品中擬人參皂苷F11已經(jīng)能被檢出。同時按公式陽性對照樣品測得含量/陽性對照樣品理論含量×100%計算擬人參皂苷F11轉(zhuǎn)移率，其中陽性對照樣品理論含量=1.299×103μg·g-1（摻入的西洋參擬人參皂苷F11含量）×西洋參摻入比例×12.5%（處方量100 g/800 g）。結(jié)果摻入不同比例西洋參樣品中擬人參皂苷F11的平均轉(zhuǎn)移率為48.67%。

表5 不同摻偽比例樣品中擬人參皂苷F11 的含量（μg·g-1）

以西洋參摻入比例為橫坐標(biāo)（X），測得的擬人參皂苷F11的含量（μg·g-1）為縱坐標(biāo)（Y），得到線性方程Y=7.697×101X+5.137×10-3（r=0.997 9），其相關(guān)性系數(shù)良好，表明西洋參摻入的量跟擬人參皂苷F11的含量呈正相關(guān)性。

3.2 摻偽限度擬定

參照已頒布的其他含人參制劑的西洋參檢查補(bǔ)充檢驗(yàn)方法中判定檢出的依據(jù)，考慮實(shí)際生產(chǎn)中非主觀原因的混入，同時模擬摻偽陽性對照樣品制備過程中轉(zhuǎn)移率較大生產(chǎn)高，擬將限度適當(dāng)放寬，以男寶膠囊中摻西洋參比例大于10%時判定為檢出西洋參，超過擬定限度。

課題組對自行收集的西洋參飲片3 批、西洋參粉1 批、西洋參對照藥材1 批進(jìn)行擬人參皂苷F11含量測定，結(jié)果見表6。

表6 自行收集西洋參中擬人參皂苷F11 的含量

由“3.1”可知，擬人參皂苷F11的平均轉(zhuǎn)移率為48.67%，結(jié)合上述5 批次擬人參皂苷F11的平均含量，計算得男寶膠囊中擬人參皂苷F11應(yīng)不得超過7.897 μg·g-1（1.298 × 103μg·g-1× 12.5% × 10% ×48.67%），即制備的相應(yīng)供試品溶液中擬人參皂苷F11濃度為9.48 ng·mL-1。

為便于操作及判斷，根據(jù)上述限量折算配制相應(yīng)濃度（10 ng·mL-1）的對照品溶液（相當(dāng)于男寶膠囊樣品中擬人參皂苷F11含量為8.3 μg·g-1），規(guī)定供試品溶液的色譜峰面積值大于該濃度的對照品溶液中相應(yīng)的峰面積值，視為檢出西洋參，超過擬定限度。

3.3 判定原則

為簡便生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制和監(jiān)管，節(jié)約資源。人參的質(zhì)量控制在原料執(zhí)行《中國藥典》2020 年版中規(guī)定的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的基礎(chǔ)上，額外增加成藥單項(xiàng)檢測擬人參皂苷F11即可。故在判定檢出西洋參超過擬定限度原則時，未對人參皂苷Rf 含量進(jìn)行限定，僅對擬人參皂苷F11進(jìn)行了詳細(xì)要求。

判定原則主要為三種情況：①供試品溶液的提取離子流色譜中，未同時出現(xiàn)與擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）色譜相應(yīng)的色譜峰，視為未檢出西洋參；②供試品溶液的提取離子流色譜中，同時出現(xiàn)與擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）色譜相應(yīng)的色譜峰，但供試品色譜中m/z 799.6→653.6 的色譜峰峰面積值不大于擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）相應(yīng)的峰面積值，視為未檢出西洋參，未超過擬定限度；③供試品溶液的提取離子流色譜中，同時出現(xiàn)與擬人參皂苷F11對照品溶液（10 ng·mL-1）色譜相應(yīng)的色譜峰，且供試品色譜中m/z 799.6→653.6 的色譜峰峰面積值大于擬人參皂苷F11對照品溶液相應(yīng)的峰面積值，視為檢出西洋參，超過擬定限度。

4 結(jié)果與分析

4.1 結(jié)果判定

72 批次男寶膠囊樣品中擬人參皂苷F11，有1批次樣品低于檢測限，其余71 批次含量范圍為0.072～43.260 μg·g-1，人參皂苷Rf 5 批次樣品低于檢測限，67 批次含量范圍為1.070～34.788 μg·g-1。根據(jù)“3.2”項(xiàng)下的限度，有22 批次樣品擬人參皂苷F11含量大于8.3 μg·g-1，檢出西洋參，超過擬定限度，問題樣品批次占比為30.56%。

4.2 含量測定結(jié)果分析

72 批次樣品結(jié)果數(shù)據(jù)繁雜，不便于結(jié)果直觀分析。故將不同生產(chǎn)企業(yè)分組繪制含量測定直方圖，以含量測定的結(jié)果（μg·g-1）為縱坐標(biāo)（詳見圖2）。為了更直觀清晰地表述，將人參皂苷Rf 含量用正軸半軸表示，擬人參皂苷F11含量用負(fù)半軸表示，圖中低于檢測限的均視為0。從直方圖可見生產(chǎn)企業(yè)S7不僅人參皂苷Rf 含量極低，而且擬人參皂苷F11含量異常高，表明整體人參原料質(zhì)量控制較差。生產(chǎn)企業(yè)S1、S4、S3 和S5 的人參質(zhì)量控制相對較好，人參皂苷Rf含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于擬人參皂苷F11含量，同時人參皂苷F11含量極低。

圖2 含量測定直方圖

5 討論

人參與西洋參為同科同屬藥材，外觀性狀與組織結(jié)構(gòu)相似，容易混淆，且西洋參生長周期較人參短，種植成本低。而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中多以兩者共有成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1來進(jìn)行質(zhì)量控制，因此存在使用西洋參摻人參進(jìn)行投料的風(fēng)險。擬人參皂苷F11和人參皂苷Rf是一對同分異構(gòu)體，文獻(xiàn)研究表明擬人參皂苷F11為西洋參中特征成分，人參皂苷Rf 為人參特征成分，可作為非法投料使用的檢驗(yàn)依據(jù)[9，10]。近年來人參中摻西洋參投料是中成藥質(zhì)量控制研究的熱點(diǎn)，特別是人參生粉入藥的相關(guān)中成藥研究已較為完備。然而男寶膠囊此類人參需提取入藥，組方復(fù)雜，生產(chǎn)企業(yè)多的中成藥相關(guān)研究較少[7，8]。

由于諸多原因未能制定男寶膠囊中人參皂苷Rf的限度，客觀原因是現(xiàn)行的人參制劑標(biāo)準(zhǔn)中未有關(guān)于人參皂苷Rf限度可以參考，同時生產(chǎn)企業(yè)配合度相對不高，制定限度欲望低；主觀原因是實(shí)驗(yàn)室制備小樣所用的原藥材質(zhì)量佳，提取效率高，可能會導(dǎo)致人參皂苷Rf限度擬定過高，質(zhì)量標(biāo)志成分的限度仍需多批次中試和大試樣品的驗(yàn)證。人參皂苷Rf的限度擬定欲在后期研究中進(jìn)一步完善。目前本著簡便高效、節(jié)約資源的原則，課題組相信生產(chǎn)企業(yè)在原料人參執(zhí)行《中國藥典》2020 年版中規(guī)定的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的基礎(chǔ)上，額外增加成藥單項(xiàng)檢測擬人參皂苷F11即可控制男寶膠囊中人參的質(zhì)量。

通過上述試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)男寶膠囊部分生產(chǎn)企業(yè)存在人參中摻西洋參投料的跡象，提示生產(chǎn)企業(yè)需加強(qiáng)風(fēng)險質(zhì)量管理意識，課題組已向國家藥品監(jiān)督管理局建議對相關(guān)制劑的投料情況進(jìn)行專項(xiàng)整治檢查。本試驗(yàn)旨在通過建立男寶膠囊中擬人參皂苷F11限量檢查方法，為生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考，鞏固國家監(jiān)管部門及社會群體對中成藥摻偽的監(jiān)管，保障中藥質(zhì)量安全。