circ_0000337靶向miR-578對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞生物學行為的影響

邵文秀 盧淑嬌 韓麗林

(麗水市人民醫院皮膚科,浙江 麗水 323000)

皮膚鱗狀細胞癌(CSCC)是一種高發病率的皮膚惡性腫瘤,盡管手術、放療和光動力等治療方案不斷進展,但腫瘤的復發和轉移仍是CSCC患者死亡的重要原因〔1〕。了解CSCC進展的分子機制對開發有效的治療策略至關重要。環狀RNA(circRNA)是豐富、穩定、進化保守的非編碼RNA,其通過與微小RNA(miRNA)或其他分子結合,抑制其功能,在轉錄或轉錄后水平介導基因表達,circRNA在CSCC等多種類型的癌癥異常表達,參與調控癌細胞多種功能,可能作為腫瘤診斷的潛在標志物或治療靶點〔2,3〕。circ_0000337在食管鱗癌組織中表達明顯上調,敲減circ_0000337通過上調致癌因子miR-670-5p表達顯著抑制食管鱗癌細胞增殖和遷移〔4〕。miR-578是一種抑癌因子,過表達miR-578可誘導膠質瘤細胞凋亡,抑制克隆形成〔5〕。circ_001621通過減弱miR-578對細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4和基質金屬蛋白酶(MMP)-9抑制作用,促進骨肉瘤的增殖和遷移〔6〕。生物信息學軟件預測到miR-578與circ_0000337存在潛在結合位點,但circ_0000337能否靶向miR-578調控CSCC進展未見報道。本研究探討circ_0000337靶向miR-578對CSCC細胞A431細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1CSCC組織來源 CSCC組織及癌旁組織(鄰近非腫瘤標本)取自麗水市人民醫院41例CSCC患者。男28例,女13例,年齡32～60歲,中位年齡45歲。組織立體后立即置于液氮冷凍,后保存在-80 ℃。本研究符合《赫爾辛基宣言》指導原則,患者均簽署書面知情同意書。

1.2細胞和試劑 CSCC細胞A431購自美國ATCC;ReverTra Ace qPCR逆轉錄試劑盒、熒光染料(SYBR) qPCR混合物(Mix)購自日本TOYOBO公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;si-NC、si-circ_0000337、miR-NC、miR-578 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0000337、anti-miR-NC、anti-miR-578購自廣州銳博生物公司;Trizol試劑、細胞計數試劑盒(CCK-8)購自南京凱基生物公司;Transwell小室購自美國BD公司;MMP-2兔多抗(ab97779)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,ab9485)、羊抗兔IgG(ab205718)、MMP-9兔多抗(ab38898)購自上海艾博抗貿易公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測circ_0000337、miR-578表達 Trizol法提取CSCC組織、癌旁組織的總RNA,用ReverTra Ace qPCR逆轉錄試劑盒將200 ng RNA逆轉錄成cDNA,然后用SYBR qPCR Mix進行RT-qPCR。以GAPDH和U6分別作為circ_0000337、miR-578的內參基因,2-ΔΔCt法計算其表達量。circ_0000337引物(上游5′-TCAGGATGCCTTGGGACT-3′,下游5′-TGTGCAGCCGGTCTAACC-3′);GAPDH引物(上游5′-CGCTCT-CTGCTCCTCCTGTTC-3′,5′-ATCCGTTGAC-TCCGACCTTCAC-3′);miR-578引物(上游5′-GTGCAGGGTGTTAGGA-3′,下游5′-GAAGAACACGTCTGGT-3′);U6引物(上游5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′,下游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′)。

1.4A431細胞培養和分組 A431細胞采用添加10%胎牛血清DMEM培養基在37 ℃、含5% CO2培養箱孵育。將對數期A431細胞(2×104個)接種于24孔板,當細胞40%時用Lipofectamine2000將40 nmol/L的寡核苷酸或2 μg質粒分別轉染A431細胞,共分為si-NC組、si-circ_0000337組、miR-NC組、miR-578組、pcDNA組、pcDNA-circ_0000337組、si-circ_0000337+anti-miR-NC組、si-circ_0000337+anti-miR-578組。轉染48 h后收集細胞,RT-qPCR檢測轉染效果后進行功能分析。

1.5CCK-8法檢測A431細胞活力 將轉染的A431細胞(5×103個)接種在96孔板中,37 ℃培養箱孵育至細胞貼壁后將10 μl CCK-8 溶液加入每個孔中。孵育2 h后,酶標儀在450 nm處測量吸光度(OD)值。

1.6克隆形成實驗檢測A431細胞克隆能力 將轉染的A431細胞(5×102個)接種在6孔板中,37 ℃培養箱孵育12～14 d直至出現細胞集落。棄去培養液,用4%甲醛固定細胞集落,用1%結晶紫染色30 min,光學顯微鏡拍照,計數大于50個細胞的集落數。

1.7劃痕愈合實驗檢測A431細胞遷移能力 將轉染的A431細胞(5×104個)接種于6孔板并在37 ℃培養箱孵育,當細胞融合為一層時,用200 μl吸管尖端劃傷細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次去除非黏附細胞,加入新鮮培養基置于37℃培養箱孵育。培養初始時、培養24 h時分別將6孔板置于顯微鏡下拍照,記錄劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8Transwell實驗檢測A431細胞侵襲能力 用無血清培養基重懸轉染的A431細胞,取200 μl接種到Transwell裝置上腔室,下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養基。在37 ℃培養箱孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定膜下表面附著的細胞20 min,并用0.1%結晶紫溶液染色。在顯微鏡下對隨機選取的5個視野細胞數量進行計數,取均值表示侵襲數。

1.9雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-578結合位點的circ_0000337野生序列或不含該結合位點的突變序列分別克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體中,構成重組載體野生型(WT)-circ_0000337、突變型(MUT)-circ_0000337,該步驟由廣州銳博生物公司完成。將WT-circ_0000337+miR-578 mimics、WT-circ_0000337+ miR-NC、MUT-circ_0000337+ miR-578 mimics、MUT-circ_0000337 +miR-NC分別轉染A431細胞。共轉染48 h后,用雙熒光素酶報告基因檢測系統分析檢測相對熒光素酶活性。

1.10Western印跡檢測A431細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達 RIPA裂解液提取總蛋白,取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后通過電印跡轉移到硝化纖維素膜上。膜封閉后,4 ℃下孵育MMP-2抗體(1∶2 500稀釋)、MMP-9抗體(1∶2 500稀釋)和內參GAPDH抗體(1∶2 500稀釋)12 h。25 ℃下孵育酶標二抗(1∶3 000稀釋)2 h。化學發光法顯色反應,Quantity One軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.11統計學方法 采用GraphPad7.0軟件進行單因素方差分析、One-Way ANOVA和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1circ_0000337和miR-578在CSCC組織中的表達 CSCC組織中circ_0000337表達(4.37±0.33)顯著高于癌旁組織(1.00±0.07;t=63.966,P=0.000),CSCC組織中miR-578表達(0.29±0.04)顯著低于癌旁組織(1.00±0.08;t=50.828,P=0.000)。

2.2抑制circ_0000337表達對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-circ_0000337組細胞中circ_0000337表達水平顯著低于si-NC組(P<0.05)。與si-NC組比較,si-circ_0000337組細胞OD值、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲數及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05),見表1、圖1。

2.3miR-578過表達對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-578組細胞中miR-578表達水平顯著高于miR-NC組(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-578組細胞OD值、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲數及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05),見圖1、表2。

表1 抑制circ_0000337表達對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4干擾miR-578表達逆轉了抑制circ_0000337表達對A431細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-circ_0000337+anti-miR-NC組比較,si-circ_0000337+anti-miR-578組A431細胞miR-578表達水平顯著降低,細胞OD值、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲數及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05),見圖1、表3。

1～6:si-NC組、si-circ_0000337組、miR-NC組、miR-578組、si-circ_0000337+anti-miR-NC組、si-circ_0000337+anti-miR-578組圖1 各組MMP-2、MMP-9蛋白表達

表2 miR-578過表達對A431細胞增殖、遷移和侵襲的影響及雙熒光素酶報告結果比較

表3 干擾miR-578表達逆轉了抑制circ_0000337表達對A431細胞增殖、遷移和侵襲的作用

2.5circ_0000337靶向調控miR-578的表達 生物信息學預測軟件顯示circ_0000337可能與miR-578存在結合位點,見圖2。

圖2 circ_0000337的序列中含有與miR-578互補的核苷酸序列

雙熒光素酶報告實驗表明,與WT-circ_0000337和miR-NC共轉染比較,共轉染WT-circ_0000337和miR-578 mimics的細胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見表2。RT-qPCR檢測顯示,與pcDNA組(1.00±0.00)比較,pcDNA-circ_0000337組細胞中miR-578表達水平(0.43±0.03)顯著降低(P<0.05);與si-NC組(0.98±0.06)比較,si-circ_0000337組細胞中miR-578表達水平(2.66±0.23)顯著升高(P<0.05)。表明circ_0000337通過直接與miR-578結合來調控miR-578表達。

3 討 論

circRNA表達失調被認為與CSCC發生和發展有關,研究表明,circ_0067772、circ_0070934、circ_001937等circRNA在CSCC中表達上調,參與CSCC細胞過度增殖、凋亡抵抗及遷移侵襲,而敲減其表達則抑制CSCC細胞惡性表型〔7～9〕。本研究檢測到CSCC組織中circ_0000337表達顯著升高,但circ_0000337在CSCC進展中的作用并未闡明。研究顯示,circ_0000337高表達與膠質瘤患者不良預后相關,circ_0000337通過靶向miR-942-5p可上調MAT2A表達,從而誘導膠質瘤細胞惡性表型〔10〕。circ_0000337在骨肉瘤細胞系表達上調,沉默circ_0000337顯著抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移能力〔11〕。為探討circ_0000337在CSCC中作用,本研究結果顯示,抑制circ_0000337表達通過降低A431細胞活力,抑制其遷移、侵襲以克隆形成能力,這與研究〔11〕報道的抗癌作用類似,表明抑制circ_0000337表達通過抑制CSCC細胞惡性生物學行為來阻礙CSCC進展。MMP-2和MMP-9可破壞血管基底膜、降解細胞外基質,在腫瘤轉移擴散中起重要作用,其表達水平與腫瘤細胞遷移和侵襲能力存在顯著相關性,是常用的腫瘤細胞侵襲轉移標志物〔12,13〕。本研究進一步證實抑制circ_0000337表達的抗遷移、抗侵襲作用。

circRNA含有miRNA結合位點,circRNA通過吸附miRNA能夠減弱其對靶mRNA的抑制作用,參與腫瘤細胞增殖和轉移過程,研究報道,circ_0000337在骨肉瘤中的致癌作用與調控miR-4458/BTB-CNC異體同源體(BACH)1通路相關〔11〕。本研究證實,miR-578為circ_0000337的直接靶點。已有研究顯示,miR-578在多種腫瘤中充當抑癌因子,如miR-578通過靶向血管內皮生長因子(VEGF)和低氧誘導因子(HIF)-1信號通路的關鍵調控因子抑制乳腺癌易感基因(BRCA)1/2相關乳腺癌血管生成〔14〕。沉默環狀RNA鋅指RNA結合蛋白(circZFR)通過miR-578顯著抑制乳腺癌細胞的惡性行為,抑制體內腫瘤的生長〔15〕。沉默circ_0005785可抑制肝癌細胞的增殖和轉移,導致細胞凋亡和細胞周期阻滯,其機制與靶向上調miR-578表達有關〔16〕。miR-578還可作為circ-CNST、circ_0006677的下游靶miRNA參與調控骨肉瘤、非小細胞肺癌進展〔17,18〕。本研究結果證實,miR-578在CSCC中的抑癌功能。RT-qPCR檢測到miR-578表達受到circ_0000337負性調控,且在CSCC中抑制circ_0000337表達和過表達miR-578的抗腫瘤作用一致,提示CSCC中存在circ_0000337/miR-578通路。本研究表明,干擾miR-578表達顯著削弱抑制circ_0000337表達對A431細胞活力及遷移、侵襲、克隆形成能力的影響,進一步證實circ_0000337靶向調控miR-578表達參與調控CSCC進展。然而,本研究仍存在不足之處,circ_0000337下游是否存在其他miRNA,miR-578下游靶點仍需探討。此外,未來仍需開展動物實驗進一步驗證circ_0000337/ miR-578通路在CSCC中的作用。

綜上,circ_0000337在CSCC中表達上調,miR-578表達下調。抑制circ_0000337通過靶向上調miR-578表達可抑制CSCC細胞A431增殖、遷移和侵襲。