分泌型卷曲相關蛋白4介導的線粒體自噬在大鼠糖尿病腎病腎間質纖維化中的作用

楊琳 屈曉群 劉敬 潘紅菊

(臨汾市中心醫院腎內科,山西 臨汾 041000)

糖尿病腎病(DN)為臨床較為常見的一種糖尿病并發癥,多發腎小管-間質纖維化、腎小球基底膜加厚、系膜增生,可造成終末期腎病,嚴重威脅患者的機體健康〔1,2〕。研究顯示〔3,4〕,DN多發生于病程超過10年的糖尿病患者,患病率為40%～50%。DN與其他類型的腎病存有一定的差異,由于其并發糖脂代謝失衡,在治療上提高了難度,臨床未發現標準治療此病的方案,主要是控制血壓、血糖及抑制蛋白的攝入,以控制病癥的發展速度〔5,6〕。及時預估早期DN且制定出個性化治療方法以延緩病癥的發展是改善患者預后的主要方法。尿微量白蛋白排泄率為臨床評估DN的重要標準,但極易受感染等因素的影響,且對腎小球及腎小管的受損狀況難以預估〔7〕。分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)4可經特異性結合細胞膜表面的卷曲蛋白的有關受體對腎纖維化的產生與進展進行有效介導〔8〕。本文分析SFRP4介導的線粒體自噬在DN腎間質纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 雄性SD大鼠由深圳華瑞模式生物科技有限公司提供,7～8 w周齡,體質量200～230 g,平均(215.30±10.05)g,動物許可證號:SYXK(粵)2022-0304;大鼠在清潔環境下給予自由飲水、正常飲食。本試驗均由嚴格按動物實驗標準予以操作,且取得醫院倫理委員會批準。

1.2建模與分組 大鼠適應性飼養1 w后開始試驗,檢測尿蛋白和尿糖定性為陰性,大鼠空腹血糖水平均處于正常范圍(3.2～7.0 mmol/L)。大鼠不禁水禁食3 h,給予其50 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射,連續注射5 d,1次/d。建模后2 w對大鼠空腹血糖水平進行測定,以血糖≥16.7 mol/L且尿糖呈陽性視為建模成功,最終有10只大鼠建模完成。另選10只相同鼠齡的正常大鼠作為對照組,腹腔注入同等劑量STZ溶酶無菌檸檬酸鈉緩沖液,連續5 d,1次/d。

1.3病理組織學觀察 取大鼠部分腎組織通過10%甲醛予以固定(48 h),梯度酒精脫水后,使用二甲苯30 min透明。用石蠟包埋、切片(4 μm),切片經梯度酒精進行脫蠟后通過蘇木素染液染色5 min,流水洗滌1 min,直至切片返藍,經伊紅染液染色3 min,流水沖洗掉伊紅染液,梯度酒精脫水,二甲苯予以透明,用中性樹膠施以封閉,光學顯微鏡下對腎組織的病理變化給予觀察。

1.4腎功能相關指標 ①收集24 h尿液,選取雙縮脲比色法檢測24 h尿蛋白(UTP)水平;②通過苦味酸法檢測血肌酐(Scr)水平;③使用速率法測定胱抑素(Cys)C、血尿素氮(BUN)水平;④使用溴甲酚綠法檢測β2微球蛋白(β2-MG)表達。

1.5線粒體氧化應激、細胞活力及炎癥水平檢測 ①稱取大鼠腎臟組織50～100 mg,除去髓質,固定于4%多聚甲醛,30 min,選用0.1% Triton X-100進行滲透(30 min),且在含Tween-20磷酸鹽緩沖鹽水內使用5%牛血清白蛋白予以封閉,將組織細胞使用75 nmol/L 溶酶體綠色熒光探針進行染色(北京伊塔生物科技有限公司,貨號:YT07420),以此對溶酶體進行觀察,通過250 nmol/L線粒體紅色熒光探針觀察線粒體。使用高分辨共聚焦顯微鏡(Nikon A1R HD25)對線粒體及溶酶體的共定位進行觀察,將組織細胞和線粒體紅色熒光探針5 μmol/L于37 ℃環境中培養10 min,并經熒光顯微鏡(上海富萊光學科技有限公司,型號:ECLIPSE MA100)檢測570 nm發射波長及520 nm激發下各組的熒光強度。②細胞活力檢測:處理組織細胞后,各孔添加CCK-8溶液(10 μl),將酶標板于37 ℃環境中培養2 h,使用自動酶標儀(北京東目儀器有限公司,型號:DJ15-M195407-Q3)檢測460 nm波長處的吸光值。③炎癥水平檢測。收集各組眼球血1 ml,于4 ℃下行離心處理(3 500 r/min離心6 min),分離血清,使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對白細胞介素(IL)-8、IL-6水平進行檢測,首先在檢測卡中標記清對照組、模型組,將血清標本、稀釋緩沖液及測試卡放置于平臺,維持24～26 ℃室溫,按比例1∶20對標準液予以稀釋,添加標準液100 μl于酶標板內,混合均勻,恒溫放約30 min,洗滌酶標板,加入50 μl抗體,放置30 min,滴加40 μl終止劑,用多功能酶標儀(廠家:北京東目儀器有限公司,型號:DJ15-M195407-Q3)對待測在酶標板波長460 nm處測吸光度值,試劑盒由北京義翹神州科技股份有限公司提供,貨號為:10098-HNCH1、10398-H08H。

1.6腎間質纖維化指標水檢測 收集大鼠1 ml眼球血,行離心處理(3 500 r/min離心8 min),提取血清,使用ELISA檢測肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子(TGF)-β1、同型半胱氨酸(Hcy)水平,試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供,貨號為:F15644、F28310、F20071。其上述檢測步驟均由具有豐富經驗的專科醫師按說明書完成。

1.7免疫組化法檢測β-catenin、SFRP4表達 60 ℃烤片、2 h后,常規脫蠟、脫水,3% 過氧化氫密封內源性過氧化物、曲拉通破膜、檸檬酸緩沖液通過微波爐煮沸直至抗原改善、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,一抗(β-catenin,1∶100;SFRP4,1∶100),在4 ℃冰箱中濕盒培養過夜,復溫0.5 h,PBS洗滌3次,37 ℃培養對應的二抗60 min,PBS洗滌3次,二氨基聯苯胺(DAB)顯微鏡下進行染色,流水洗滌,蘇木素光鏡下進行復染,清水洗滌,常規脫水透明,曬干,用中性樹脂進行封片后,光鏡下檢測蛋白的水平表達。內參為β-actin。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗、配對t檢驗。

2 結 果

2.1病理組織學觀察 如圖1所示,對照組腎小球及腎小管組織的形態正常。DN模型組腎小球系膜產生顯著增生、腎小球基底膜有所增厚,顯著腎纖維化,腎小球的囊腔縮減,且存在毛細血管積聚。

2.2兩組腎功能相關指標對比 如表1所示,與對照組比較,DN模型組CysC、Scr、BUN、UTP、β2-MG水平均上升,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3兩組腎間質纖維化指標水平對比 如表1所示,與對照組對比,DN模型組Hcy、TGF-β1表達上升,HGF表達下降,具有統計學差異(P<0.05)。

2.4各組線粒體氧化應激、細胞活力及炎癥水平對比 如表2所示,與對照組比較,DN模型組相對線粒體ROS、IL-8、IL-6表達升高,細胞活力降低,具有統計學差異(P<0.05)。

2.5兩組β-catenin、SFRP4表達水平對比 如表2、圖2所示,與對照組對比,DN模型組β-catenin、SFRP4表達升高,具有統計學差異(P<0.05)。

圖1 兩組腎組織(HE染色,×400)

表1 兩組腎功能相關指標及腎間質纖維化指標對比

表2 兩組線粒體氧化應激、細胞活力、β-catenin、SFRP4表達及炎癥水平對比

圖2 Western印跡檢測兩組β-catenin、SFRP4蛋白表達

3 討 論

隨著病情的進展,DN可引起患者產生終末期腎衰竭,甚至發生死亡。且因DN患病率高,治療時間較長且預后療效較差等特征,給臨床治療帶來了較大的困難〔9～11〕。

由于腎臟中含有較為豐富的線粒體,故而線粒體的正常功能對保證腎功能良好發揮了較為重要的作用〔12〕。在正常狀況下,機體會選擇性的消退被損害及功能失衡的線粒體,從而保證細胞的平穩性,因此,長期受高糖的刺激會導致線粒體極易受損,使得活性氧提升,線粒體膜電位降低,致使線粒體功能異常,大量功能失衡的線粒體會在細胞中聚積,造成細胞內的環境失衡,致使細胞發生反應,如纖連蛋白及細胞外基質內Ⅳ型膠原蛋白的積聚,從而造成腎纖維化,纖維化為DN的重要病理改變之一〔13,14〕。線粒體自噬可通過消除功能失衡及被損害的線粒體,為線粒體質量把控的主要途徑〔15〕。故而提升線粒體自噬可及時性的除去受損的線粒體以保持細胞的平衡及線粒體功能異常,進而減少細胞外基質的積聚,以改善DN大鼠病癥。線粒體功能異常在調節氧化應激、炎癥水平及細胞凋亡方面發揮著重要的作用,這與DN的發病機制密切相關。

SFRP為近來新研究發現的分子量為40 kD的一種可溶性脂肪細胞因子,可參與調節Wnt信號通路,而Wnt信號通路被證實可誘導DN的發生,抑制Wnt信號通路表達可作為潛在治療DN的重要靶點〔16,17〕。研究發現〔18〕,SFRP1參與早期DN的患病過程。研究顯示〔19〕,SFRP5與糖尿病腎病的病癥嚴重程度的發展有著緊密聯系。研究發現〔20〕,SFRP4參與骨代謝、惡性腫瘤、胰島素抵抗、糖尿病等。本文發現,SFRP4通過介導線粒體自噬,可有效減緩DN的進展,改善腎功能指標,抑制腎間質纖維化的發展,控制血糖,以減輕DN的嚴重程度,與其他相關學者研究較相似〔21～23〕;表明SFRP4下降可有效抑制DN大鼠腎組織中線粒體自噬能力過度,這一病理變化可能與改善線粒體功能異常過程有關。以后可進一步探究SFRP4如何對線粒體自噬進行有效調節,旨在確定SFRP4在DN進展中的臨床意義及潛在作用機制。